白细胞介素12基因修饰大鼠胶质瘤9L/ rIL-12细胞的建立

　　作者：林健,戴学军,王伟民,张宏斌,武婕　　作者单位：中国人民解放军广州军区广州总医院 1. 神经外科; 2. 医学实验科， 广东 广州 510010

　　【摘要】目的构建大鼠白细胞介素12 (rIL-12) 基因真核表达载体质粒，建立rIL-12基因修饰并稳定表达的大鼠胶质瘤9L/rIL-12细胞。 方法 用Trizol提取大鼠腹腔巨噬细胞总RNA，RT-PCR方法分别获取rp40和rp35 cDNA，依次克隆入pcDNA3.1(-)/myc-His A质粒中，以IRES连接双亚基，构建成双顺反子真核表达载体质粒pcDNA3.1/rIL-12。将构建的重组质粒转染大鼠胶质瘤9L细胞，G418筛选单克隆细胞株，ELISA法检测其培养上清rIL-12 (p70) 蛋白含量，同时抽提细胞RNA，RT-PCR方法检测rp40、rp35基因在9L/rIL-12细胞中的表达。 结果 所得rp40cDNA序列与Gene Bank NM022611及AF133197、rp35cDNA序列与Gene Bank NM053390及AF177031均一致，构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。质粒转染9L细胞后，获得2个rIL-12基因稳定、高效表达的9L/rIL-12单克隆细胞株，其培养上清rIL-12 (p70) 蛋白含量分别为139.0、162.1 pg/ml，RT-PCR结果显示细胞中rIL-12基因表达呈阳性。 结论 成功构建了rIL-12真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12，并建立了9L/rIL-12细胞株，为rIL-12基因修饰的胶质瘤疫苗研究打下了基础。

　　【关键词】 大鼠 白细胞介素12 质粒 神经胶质瘤 9L细胞

　　Establishment of rat glioma 9L/rIL-12 cells genetically modified by interleukin 12 genes

　　LIN Jian, DAI Xuejun, WANG Weimin, et al

　　Department of Neurosurgery, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China

　　Abstract: Objective To construct eukaryotic expression plasmid containing rat interleukin 12 (rIL-12) genes and establish 9L/rIL-12 strains stably expressing rIL-12. Methods Both rp40 and rp35 cDNA of rIL-12 were amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) from total RNA of rat peritoneal macrophages stimulated by lipopolysaccharide (LPS). The amplified fragments were inserted into eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(-)/myc-His A respectively. Both p40 and p35 cDNA were linked by internal ribosome entry site (IRES). The constructed plasmid pcDNA3.1/rIL-12 was identified by PCR, restriction enzyme digestion, and DNA sequence analysis. Then the constructed plasmid was transfected into rat glioma 9L cells. The 9L/rIL-12 monoclonal cell strains were selected with G418 subsequently. The expression of rIL-12 gene in 9L/rIL-12 cells was detected by ELISA and RT-PCR. Results The sequences of p40 and p35 cDNA were consistent with GenBank NM022611, AF133197 and GenBank NM053390, AF177031 respectively. The constructed plasmid was confirmed by PCR, restriction enzyme digestion and sequencing. Two monoclonal strains with stably and highly expressed rIL-12 genes were gained, and the concentration of rIL-12 p70 protein in culture supernatant of 9L/rIL-12 strains was 139.0 and 162.1 pg/ml respectively. RT-PCR demonstrated expression of both rp40 and rp35 subunit genes in 9L/rIL-12 cells. Conclusion The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1/rIL-12 has been constructed successfully and 9L/rIL-12 strains established, which provides a foundation for studying glioma vaccine modified by IL-12 gene.

　　免疫治疗被视为有前景的胶质瘤治疗新模式。利用免疫细胞因子及基因治疗可以增强机体抗肿瘤的免疫反应，其中白细胞介素12 (IL-12) 以其广泛的生物学效应、强大的抗肿瘤作用，被誉为最有效的抗肿瘤细胞因子之一[1，2]。

　　本研究利用脂多糖 (LPS) 刺激体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞，提取细胞RNA，RT-PCR扩增出大鼠IL-12 (rIL-12) 的rp40及rp35 cDNA，将之依次亚克隆至pcDNA3.1(-)/myc-His A 质粒中，并用脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点 (internal ribosome entry site，IRES) 进行连接，构建成rp40及rp35两亚基的双顺反子真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12，应用该质粒转染大鼠胶质瘤9L细胞，建立rIL-12基因稳定表达的9L/rIL-12细胞株。

　　1 材料与方法

　　1.1 细菌、质粒与细胞 大肠杆菌感受态细胞DH-5α为Tiangen产品。 pcDNA3.1(-)/myc-His A/IRES质粒由英国格拉斯哥大学免疫和细菌学室Xiaoqing Wei博士惠赠。野生型大鼠胶质瘤9L细胞株由美国洛杉矶加州大学神经外科Linda M Liau博士惠赠。

　　1.2 实验动物 雄性Wistar大鼠购于南方医科大学实验动物中心 (粤检证字2002A041)，5~6周龄，体质量 (250 ± 50) g，由广州军区广州总医院医学实验动物中心按清洁级动物饲养。

　　1.3 主要试剂 LPS为Sigma产品，Trizol、G418、LipofectamineTM 2000为Invitrogen产品，各种限制性内切酶、高保真Pyrobest Taq酶、T4DNA连接酶为TaKaRa产品，反转录试剂盒为Promega产品，凝胶回收试剂盒为U-gene产品，质粒提取试剂盒为Tiangen产品，大鼠IL-12 (p70) ELISA试剂盒为Biosource产品，DMEM、胎牛血清 (FBS) 均为Gibco产品。

　　1.4 引物设计与合成 参照Gene Bank中rIL-12的cDNA 序列，利用Vector NTI Advance 10 软件设计rp40和rp35的PCR引物，rp40上游引物5'端加上XhoⅠ (CTCGAG) 酶切位点，下游引物5'端加上NotⅠ(GCGGCCGC) 酶切位点，rp35上游及下游引物5'端均加上EcoRⅠ(GAATTC) 酶切位点。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 基因为RT-PCR内参，长度为252 bp (表1)。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

　　1.5 大鼠腹腔巨噬细胞的制备及IL-12基因的克隆 参照文献[3]提取Wistar大鼠腹腔巨噬细胞，加入10 μg/ml LPS培养12～24 h，收集细胞，Trizol提取细胞总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，分别用rp40、rp35引物PCR扩增rp40、rp35基因片段;反应条件：预变性 94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s、63 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s循环30次，延伸 72 ℃ 5 min，4 ℃ 保持。1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，紫外灯下切割目标基因条带，凝胶回收基因片段。分别以XhoⅠ、NotⅠ双酶切rp40基因片段，EcoRⅠ单酶切rp35基因片段，酶切产物电泳分离，再次凝胶回收、纯化，获得可以用于亚克隆的两基因片段。

　　1.6 重组质粒pcDNA3.1/rIL-12的构建及鉴定 具体方法参照文献[4]，分两步构建：首先以XhoⅠ、NotⅠ双酶切载体质粒pcDNA3.1(-)/myc-His A-IRES，回收线性化的载体片段并与rp40基因片段连接，构建中间质粒pcDNA3.1/rp40-IRES。然后以EcoRⅠ单酶切质粒pcDNA3.1/rp40-IRES，回收线性化的载体片段，再与rp35基因片段连接构建pcDNA3.1/rp40-IRES-rp35 (即重组质粒pcDNA3.1/rIL-12)。以重组质粒为模板，PCR鉴定rp40、rp35基因的表达。分别用EcoRⅠ单酶切、XbaⅠ单酶切、XbaⅠ和 NotⅠ双酶切重组质粒，并利用Vector NTI Advance 10软件预测酶切结果。质粒DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成，以测序结果鉴定rp35基因插入方向正确与否。构建的重组质粒经鉴定正确后，大提质粒备用。

　　1.7 质粒pcDNA3.1/rIL-12转染9L细胞 9L细胞的培养参照文献[5]。重组质粒采用脂质体介导方法和电穿孔方法转染野生型9L细胞。脂质体介导转染方法按LipofectamineTM 2000说明书进行。电穿孔方法按Gene pulser XcellTM electroperation System (Bio Rad产品) 操作指南进行，参数为方波、300 V、20 ms。

　　1.8 9L/rIL-12单克隆细胞株的建立及rIL-12的表达 质粒转染9L细胞后，G418 (终浓度600 μg/ml) 筛选7～14 d，采用有限稀释法和画圈法挑取单克隆细胞株培养、扩增、传代。将筛选的单克隆细胞株各代细胞分别取5 × 106细胞数，用10 ml 含G418的DMEM完全培养液定量培养72 h，取上清，按Biosource试剂盒说明书，采用ELISA方法检测rIL-12 (p70) 浓度;同时用Trizol抽提细胞的总RNA，RT-PCR检测细胞中rp40、rp35基因的表达。

　　2 结 果

　　2.1 rIL-12基因克隆及重组质粒构建 经LPS刺激的大鼠腹腔巨噬细胞提取的RNA经RT-PCR扩增出rp40及rp35 cDNA片段，大小分别约为1 008 bp和647 bp，酶切纯化后依次亚克隆入载体质粒pcDNA3.1(-)/myc-His A-IRES相应的位点，构建成rp40和rp35两亚基双顺反子真核表达的重组质粒pcDNA 3.1/rIL-12 。

　　2.2 重组质粒鉴定 以重组质粒为模板行PCR扩增，产物电泳显示rp40和rp35条带清晰 。质粒酶切鉴定，电泳条带与预测吻合 ，其中EcoRⅠ单酶切可将插入的rp35基因切下;rp40基因中存在1个XbaⅠ酶切位点，XbaⅠ单酶切质粒出现3条带;XbaⅠ和NotⅠ双酶切因缓冲体系不同仅出现2条带。重组质粒测序结果与Gene Bank比对，rp40cDNA序列与NM022611及AF133197、rp35cDNA序列与NM053390及AF177031均一致，rp35基因插入载体质粒方向正确。

　　2.3 9L/rIL-12细胞的建立及rIL-12基因表达 重组质粒转染野生型大鼠9L细胞后，共获得12个9L/rIL-12单克隆细胞株，其中第2、7号单克隆细胞株传至第5代，以5.0 × 106 细胞数/10 ml定量培养72 h，ELISA检测培养上清中rIL-12 (p70) 蛋白浓度分别为139.0、162.1 pg/ml。Trizol抽提2、7号克隆株第5代细胞总RNA，RT-PCR结果显示rp35和rp40基因表达均为阳性 。

　　3 讨 论

　　IL-12最早称为自然杀伤细胞刺激因子 (NKCSF)[6]或细胞毒淋巴细胞成熟因子 (CLMF)[7]。IL-12具有广泛的生物学活性，主要有以下功能：①促进T细胞及NK细胞增殖，并通过促进分泌IFNγ而增强其杀伤活性;②促进Th1型细胞免疫反应;③促进多种黏附分子和MHC分子的表达，从而增强肿瘤细胞的免疫原性;④抑制瘤体内新生血管形成，从而抑制肿瘤生长;⑤促进一氧化氮生成，导致肿瘤细胞凋亡;⑥特别具有对抗TGF-β、PGE-2、IL-10、IGF-Ⅰ等胶质瘤分泌的免疫抑制细胞因子作用，从而有助于改善肿瘤局部免疫抑制状态的微环境。IL-12是最有效的抗肿瘤细胞因子之一，是连接体内天然免疫与特异性免疫的桥梁[1，2]。

　　IL-12主要由抗原提呈细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞等以“旁分泌”的形式在局部发挥作用。全身给药时，不仅肿瘤局部IL-12浓度难以达到抗肿瘤的要求，而且大剂量的反复应用可引起严重副反应，在脑瘤治疗中可引起严重脑水肿。将IL-12基因转导细胞后再用于体内，通过细胞表达，IL-12以旁分泌的形式在局部发挥作用，副反应小，更符合其在体内作用的生理模式[8]。

　　IL-12是由二硫键连接两亚基的异二聚体，两亚基相对分子质量为35 ku和40 ku，由位于不同染色体上的基因p35和p40编码，其中p35亚基决定IL-12的种属特性，而p40亚基包含与IL-12受体结合的必需基团，且其前端包含促进IL-12分泌至细胞外的信号肽。p40单体或同二聚体可与IL-12竞争结合受体而强烈拮抗IL-12的生物学活性，在转染哺乳动物细胞时，只有两亚基在体内等量表达并正确折叠，才能形成有生物学活性的IL-12[6，7]。因此，采用其进行基因治疗前，必须构建两亚基等量共表达的载体[9]。目前国内外学者多采用IRES连接p40和p35的方法构建双亚基共表达的载体，通过IRES在翻译过程中的内启动作用实现同一转录水平上的等量表达。

　　国内已经有成功克隆小鼠IL-12基因的报道[10]，但大鼠IL-12基因克隆尚未见文献报告。本研究通过提取大鼠腹腔巨噬细胞总RNA，RT-PCR扩增出rIL-12的rp40及rp35 cDNA，将其依次克隆至pcDNA3.1(-)/myc-His A质粒中，并用IRES连接，构建成同时含rIL-12 rp40及rp35两亚基的双顺反子真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12。将构建的质粒转染大鼠胶质瘤细胞9L，获得rIL-12基因稳定表达的9L/rIL-12单克隆细胞株，其培养上清经ELISA检测，rIL-12(p70) 蛋白分泌量达139.0、162.1 pg/ml。大鼠IL-12双顺反子真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12的成功构建及9L/rIL-12细胞株的建立，为IL-12基因修饰的大鼠胶质瘤疫苗研究打下了基础。

　　【参考文献】

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　　[9] CHEN L, CHEN D, BLOCK E, et al. Eradication of murine bladder carcinoma by intratumor injection of a bicistronic adenoviral vector carrying cDNAs for the IL-12 heterodimer and its inhibition by the IL-12 p40 subunit homodimer [J]. J Immunol, 1997, 159(1): 351-359.