NFκB通路对MPTP慢性帕金森病模型早期多巴胺神经元BclxL表达的双重调节

　　作者：张江伟 李志伟1 彭国光 作者单位：(重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆 400016)

　　【摘要】 目的 研究NFκB通路依赖的BclxL表达在1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶 (MPTP) 慢性帕金森病 (PD) 模型早期DA神经元中的表达过程，探讨NFκB通路在PD发病机制中的可能作用。方法 选择雄性C57BL/6小鼠，随机分为对照组和模型组及干预组，而每组于末次MPTP注射时间点算起，分为12、24 h、1及2 w 4个亚组(n=5)。动态观察小鼠的行为学和黑质BclxL表达及TH阳性神经元数目的变化及NFκB抑制剂PDTC对上述结果的影响。结果 NFκB通路的效应呈时间依赖性，模型组在12～24 h时，BclxL蛋白和mRNA表达较对照组增加(P<0.05)，在1～2 w时,BclxL表达较前者及对照组减少(P<0.05);在2 w时，模型组TH阳性细胞数较对照组减少(P<0.05)，而干预组阳性细胞较模型组增多(P<0.05)。结论 NFκB通路对慢性PD模型早期多巴胺神经元BclxL表达具有双重调节作用。

　　【关键词】 帕金森病;NFκB通路;DA神经元;MPTP慢性模型

　　帕金森病 (PD) 是一种常见的中枢神经系统变性疾病，确切病因和发病机制到目前尚未清楚。越来越多的研究表明，炎症和凋亡在PD发病中均起重要的作用，二者之间存在着密切联系，NFκB通路是二者联系的一个关键点，而国内外对NFκB通路在炎症反应中的时间依赖性效应研究较少。为探讨NFκB通路在多巴胺(DA)神经元凋亡机制中的作用，并进一步为NFκB通路抑制剂在PD治疗中的合理应用提供重要实验依据，我们复制了MPTP诱导的慢性PD小鼠模型，检测中脑DA神经元中BclxL蛋白及mRNA表达情况和TH阳性细胞数，同时观察NFκB抑制剂PDTC对上述指标的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 雄性6～8周龄C57BL/6小鼠，体重为18～23 g，购于重庆医科大学动物中心。饲养在饲料和水充足、光线合适的标准动物房中，实验前动物适应环境1 w。

　　1.1.2 主要试剂 RTPCR试剂盒(Toyobo公司)，MPTP(Sigma，USA)，兔抗BclxL多克隆抗体、兔抗TH多克隆抗体、免疫组化检测试剂盒为武汉博士德生物工程公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组和模型制备 选择雄性C57BL/6小鼠60只，随机分为对照组、1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶 (MPTP) 模型组和干预组 (MPTP +PDTC)，各组又分为12、24 h、1及2 w 4个亚组(n=5)，于末次MPTP注射时算点起。模型组注射丙磺舒 (250 mg·kg-1·次-1) +MPTP (25 mg·kg-1·次-1)，腹腔注射，每次MPTP注射前半小时注射丙磺舒，每周两次，连续5 w〔1〕;干预组于每次MPTP注射后2 h侧脑室立体定位注射PDTC。根据小鼠的行为学改变，评价模型是否成功制备。在与模型组大体相同的时间点，对照组经同样注射方式给予相同体积生理盐水注射。

　　1.2.2 定位注射 10%水合氯醛腹腔麻醉后，动物俯卧位固定，无菌条件下作颅顶正中切口，以25 μl注射器作为注射针，进行立体定位注射，注射坐标为：AP0.4 mm，ML+1.5 mm，DV2.2 mm，注射量为5 μl，15 min内匀速注射完后留针10 min，最后缓缓退针，消毒缝合伤口。

　　1.2.3 观察小鼠行为学变化 在模型制备的过程中，观察MPTP模型组、对照组、干预组及相应亚组，判断是否出现静止性震颤、运动减少等行为学改变，找出组间和组内差异。根据行为学表现，评价模型是否制备成功。

　　1.2.4 RTPCR法检测BclxL表达 提取小脑黑质总RNA，然后在42℃ 20 min条件下逆转录为cDNA。在基因库中查取目的基因BclxL和内参GAPDH的整个核苷酸序列，利用Premier 5.0设计得其引物，BclxL引物正义链：5′GGA GAG CGT TCA GTG ATC3′，反义链：5′CAA TGG TGG CTG AAG AGA3′，扩增产物长度为368 bp;内参GAPDH引物正义链：5′CTC GTG GTT CAC ACC CAT3′，反义链：5′GGC TGC CTT CTC TTG TGA3′，扩增产物长度为496 bp。PCR反应条件：94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 120 s，循环35次后74℃延伸10 min。将PCR扩增的产物进行电泳。电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察结果，完毕后电泳分析。电泳条带采用BioRad公司Quantityone 4.0图像分析软件行扫描分析。各条带的相对光密度值=目的条带光密度值/内参GAPDH条带光密度值。

　　1.2.5 免疫组化检测 在不同组不同时间点，用10%水合氯醛4 ml/kg麻醉小鼠后，切开胸骨，暴露心脏，将穿刺针经左心室刺入升主动脉，剪开右心耳。室温条件下先灌注生理盐水100～120 ml，然后4℃ 4%多聚甲醛120 ml内固定，速度先快后慢。接着断头取脑，脑组织投于4%的多聚甲醛固定24 h;常规脱水透明石蜡包埋后，切片(片厚5 μm)进行免疫组织化学 (SABC法) 染色，最后倒置显微镜观察照相。

　　1.2.6 统计学处理 各组每只动物的5张脑片数值相加后取平均值，数据资料以x±s表示，结果使用SAS统计软件进行统计学处理，多组间比较先进行方差齐性检验，方差齐者进行方差分析，方差不齐着进行秩和检验。

　　2 结 果

　　2.1 RTPCR BclxL mRNA的A260吸光度 (OD) 分析显示：12 h时，模型组中脑黑质BclxL mRNA OD值由对照组的0.467±0.041增加为0.684±0.059，差异具有统计学意义(P<0.05)，在24 h时表达达到高峰;在1～2 w时，其OD值较对照组分别减少为0.422±0.038，0.395±0.032，差异具有统计学意义(P<0.05)，且前后时间之间BclxL mRNA表达有差别，差别有统计学意义 (P<0.05)，图1。

　　2.2 黑质区BclxL的表达和分布 免疫组化结果显示，BclxL蛋白主要表达在胞浆，BclxL阳性细胞胞浆呈黄褐色，而细胞核和细胞膜没有黄染。对照组BclxL阳性细胞较少，细胞胞浆有少量黄染。在12 h时，模型组黑质区BclxL蛋白较对照组表达增高，细胞胞浆出现鲜艳黄色，并且阳性细胞较多，二者差别有统计学意义(P<0.05);在2 w时，BclxL阳性细胞胞浆较12 h变淡(P<0.05)。干预组结果与模型组恰恰相反，见图2。

　　2.3 黑质区TH阳性神经元数量变化 以模型组MPTP末次注射后2 w为时间参照，对照组可见到大量致密TH阳性DA神经元，成规则条带状分布，而模型组TH阳性细胞稀疏，排列相对混乱。统计分析显示，TH阳性细胞数变化由对照组的145.2±12.1降低为模型组的69.7±5.4，差异有统计学意义(P<0.05)，而干预组较模型组增加为121.4±8.9，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

　　2.4 行为学评价 模型组在第3周给予MPTP后15 min，出现前肢抬举伴震颤，后肢僵硬，窜蹦，持续10 min，然后出现活动减少，对外界反应迟钝。随着注射次数的增多，上述症状加重。而对照组基本没有上述表现，干预组虽然有症状，但程度轻微。模型组的行为学表现符合慢性C57BL小鼠PD模型成功标准。

　　3 讨 论

　　PD是最常见的神经系统变性疾病之一，病因和发病机制不甚清楚，可能涉及诸多分子和细胞机制，如线粒体功能障碍、氧化应激、α突触核蛋白过表达和聚集作用等。近年来，炎症在PD发病机制中的作用日益受到重视〔2〕，其可能启动、加速、加重DA神经元的慢性、进展性、不可逆性损伤。而慢性MPTP小鼠模型导致PD样选择性DA神经元减少，在神经元减少总数中，炎症引起者占90%〔3〕，且形式主要为凋亡。因此，本课题选择的慢性MPTP小鼠模型，是一种较为理想的PD动物模型。

　　众多研究表明，NFκB通路与炎症关系密切〔4〕，它不仅介导急性炎症反应，而且在慢性炎症反应中也起重要作用，例如阿尔茨海默病(AD)、PD〔5〕。在PD中，NFκB通路蛋白作为Lewy小体组成成分之一，依赖DA神经元表面的细胞因子受体被激活后，通过介导下游靶基因BclxL，P53等〔6〕，调控神经元凋亡。因此，NFκB通路参与了PD的病理生理演变过程。而NFκB蛋白是NFκB/Rel蛋白质家族成员之一，主要包括RelA/P65、cRel、RelB、p50/p105和p52/p100，它们共同拥有一个保守的Rel同源结构区 (RHD)，RHD内含有DNA结合部位、二聚体化区域和核定位信号。研究发现，NFκB家族成员中仅有cRel和RelA的DNA连接位点位于BclxL的启动子上，对BclxL的表达发挥特异性调节作用。Hunot〔7〕用免疫组化观察PD病人中脑多巴胺神经元中NFκB的表达和定位，结果显示，DA神经元内NFκB阳性细胞核的数目较对照组增加70%，其中主要为RelA。裴正斌等〔8〕在MPTP小鼠模型中也证实了RelA/P65的存在。而BclxL蛋白是一种线粒体膜蛋白，主要通过抑制线粒体膜电位的下降，阻止细胞色素C的释放，发挥抗凋亡作用。在脑部，BclxL主要在神经元中表达〔9〕。本实验结果与Veech等〔10〕的细胞模型结论基本一致。NFκB通路这种时间依赖性的效应可能与神经元所处内环境有关。在模型初期，BclxL表达量增加是对ROS和细胞因子毒性产生的一种适应性反应，并且只有在线粒体电子传递链正常时才能刺激这种抗凋亡蛋白的产生。随着疾病的进展，电子传递功能障碍及线粒体DNA损伤，BclxL表达量并不增加甚至减少。因为NFκB的活化效应依赖完整的电子传递链 (ECT) 功能。内环境的改变可能导致NFκB通路激活不同的靶基因。在初期，TNFα和IL1通过NFκB通路直接促进BclxL表达，发挥抗凋亡效应，这与众多关于NFκB通路的抑制凋亡作用的报道一致;随着炎症的加剧以及由此引起的DNA损伤，促使NFκB通路向促进凋亡方向转变，虽然目前还没有NFκB通路促进凋亡机制的确切报道，但多数学者把NFκB通路的靶基因p53作为研究的重点，即NFκB通路依赖的p53表达促进了细胞的死亡。这已在6HODA模型〔11〕中得到证实。而p53促进凋亡的机制之一就是抑制BclxL的表达和作用。当然，在MPTP小鼠模型中，这种作用机制是否起作用，以及在多大程度上起作用，还有待于进一步研究。

　　总之，NFκB通路复杂而精细，丰富又特异。虽然NFκB通路对DA神经元中的BclxL表达具有双重调节作用，但由于利弊之间的失衡，最终导致神经元的减少，加速了PD发生、发展进程。因此，NFκB通路抑制剂在PD治疗中的合理应用有望成为一个新的研究方向。

　　【参考文献】

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　　8 裴正斌，彭国光.MPTP帕金森病小鼠黑质的NFκB表达及其意义〔J〕.中国神经精神疾病杂志，2006;32(3)：279.

　　9 Gonzalez GM，Garcia I，Ging LY,et al.Bclx is expressed in embryonic and postnatal neural tissue and functions to prevent neuronal cell death〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1995;92(4):43048.

　　10 Veech GA，Dennis J，Keeney PM,et al.Disrupted mitochondrial electron transport function increases expression of antiapoptoic bcl2 and bclx(L) proteins in SHSY5Y neuroblastoma and in Parkinson disease cybrid cells through oxidative stress〔J〕.Neurosci Res，2000;61(6)：693700.

　　11 Liang ZQ，Li YL，Zhao XL,et al. NFkappaB contributes to 6hydroxydopamineinduced apoptosis of nigral dopaminergic neurons through p53〔J〕.Brain Res，2007;1145(317)：190203.