颞叶癫（疒间）海马神经元凋亡机制的研究进展

　　作者：卢峰　　

　【摘要】 颞叶癫(疒间)的海马病理变化分子机制一直是神经学科研究的重点。在发现海马致(疒间)灶中存在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3 (caspases-3) 后，学者们推测凋亡机制可能对颞叶癫(疒间)海马病理的形成具有一定作用。近年来，许多学者建立了相应的实验模型或活体标本，以凋亡基础理论为依据，从不同角度对颞叶癫(疒间)中海马神经元损伤的凋亡机制进行研究，相继发现了凋亡级联效应途径中其他分子的显著表达，包括死亡受体、凋亡效应酶、凋亡调节蛋白等，甚至在基因水平找到了凋亡存在的证据，同时也引发了抗凋亡的治疗研究，为颞叶癫(疒间)海马神经元损伤分子机制的进一步研究及颞叶癫(疒间)的药物治疗研究提供了理论基础。本文对此进行综述。

　　【关键词】 癫(疒间)，颞叶; 海马; 神经元; 细胞凋亡

　　颞叶内侧癫(疒间) (MTLE) 是指颞叶内侧海马病变导致的癫(疒间)，临床主要表现为复杂部分性发作，病理以海马硬化为典型特征。动物实验证明：短暂或持续的癫(疒间)发作可导致脑内神经元凋亡和多种凋亡相关基因的表达，如凋亡调节蛋白、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 (caspases) 家族成员等[1]，其中caspase-3是细胞凋亡信号转导通路的关键效应酶，caspase-8和 caspase-9启动的内外源性凋亡途径均与之密切相关。caspase-3在神经系统轴突的引导、突触的可塑性、神经保护及缺血耐受等方面均可发挥重要作用[2]，故单一caspase-3指标的检测不能证实凋亡途径的存在。Uysal等[3]采用dUTP缺口末端标记技术 (TUNEL) 检测，没有在颞叶癫(疒间)病人切除标本中发现断裂的DNA片断，因此，凋亡机制在颞叶癫(疒间)海马神经元中是否存在尚有疑问。为此，研究者们以凋亡基础理论为依据，进行了包括死亡受体、凋亡效应酶、凋亡调节蛋白等凋亡途径中其他相关分子的研究，甚至在基因水平找到了凋亡存在的依据，从不同方面证实了凋亡机制在颞叶癫(疒间)海马神经元中的存在。

　　1 凋亡机制的分类

　　凋亡途径主要分为死亡受体途径 (内源性途径) 和线粒体途径 (外源性途径)。细胞色素C (CytC) 释放是线粒体参与细胞凋亡外源性途径的主要分子，CytC一旦释放，即与细胞凋亡蛋白酶活化因子-1 (apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1) 结合，在dATP/ATP存在条件下形成多蛋白复合物，即凋亡体，继而活化caspase-9，后者再激活下游效应caspase (包括caspase-3、caspase-6或caspase-7等)，效应caspase诱导细胞凋亡[4]。内源性凋亡途径的主要通路有：①Fas/FasL信号途径。FasL为同源三聚体，可与细胞膜上3个Fas分子结合，并通过其胞内域与细胞质中的Fas死亡结构域相关蛋白 (Fas associated death domain，FADD　) 的DD结合，继而通过FADD末端死亡效应结构域 (death effector domain，DED) 与邻近caspase-8中的DED结合，使caspase-8寡聚化，自身裂解而活化caspase-8，最终激活下游caspase-3，导致细胞凋亡。②肿瘤坏死因子受体1 (TNFR-1) 信号途径。TNF与TNFR-1结合，三聚体化的TNFR-1通过DD与TNFR-1相关蛋白 (TNFR-1-associated death domain，TRADD) 结合，TRADD的DD再与FADD结合，下传凋亡信号，活化caspase-8，然后激活下游的caspase-3，导致细胞凋亡[5-6]。同时活化的caspase-8能够裂解Bid蛋白，从而导致CytC的释放，caspase-8是连接内外源途径的桥梁。③颗粒酶B途径。该途径较少见。颗粒酶B直接剪切并活化caspase-3，后者作用于细胞内底物而介导凋亡，或该酶剪切Bid而产生tBid，后者于Bax转位于线粒体，介导CytC释放，激活caspase级联反应。

　　因此，凋亡是多种分子的级联反应，这些分子是凋亡途径中不可缺少的，它们的异常表达介导了凋亡的发生，在病灶形成中具有重要意义。该理论为颞叶癫(疒间)凋亡机制的研究及抗凋亡作用的研究提供了基础理论依据。

　　2 凋亡相关分子的最新研究

　　2.1 凋亡受体的研究 Tan等[7]通过对癫(疒间)点燃模型的研究，发现海马病灶中的fas免疫反应明显增强，并通过TUNEL染色证实了fas诱导与细胞凋亡有关。尚伟等[8]在颞叶癫(疒间)海马活体标本中，用免疫组化法检测到fas蛋白的显著表达，而在因颞叶脑血管畸形而切除前颞叶的标本中没有发现fas表达，同时在电镜下观察到癫(疒间)组标本具有早期凋亡征象的神经元。凋亡的发生也可由细胞表面表达的死亡受体激发，如TNFR-1，死亡受体在癫(疒间)发作后迅速聚集，并招募接头蛋白FADD和起始caspase[9-10]，启动下级效应。Yamamoto等[11]对颞叶癫(疒间)病人的海马手术标本与尸体解剖标本进行了对照研究，采用Western-Blotting法发现：癫(疒间)组病人的TRADD、启动caspase-8、ASK1含量明显高于对照组;对细胞的亚分区研究发现：在细胞质中，肿瘤坏死因子受体1、TRADD、FADD明显升高，微粒体中TRADD、启动caspase-8明显升高;应用免疫沉淀可以检测测到TRADD-FADD结合分子;荧光显微镜检查可见TRADD与FADD连接。该结果说明：在TNFR-1、fas介导的凋亡信号传导通路中，这些分子的表达是必不可少的;并提示了病灶中正在发生的凋亡现象，从而从死亡受体水平进一步证明了凋亡是颞叶癫(疒间)海马神经元损伤的机制之一。

　　2.2 凋亡效应酶的研究 脱氧核糖核酸链片断化通常被认为是癫(疒间)发作诱导细胞死亡的生物化学特征[12]。凋亡细胞中的末期DNA链断裂是由一些核酸酶介导的，包括caspase激活的脱氧核糖核酸酶 (caspase-activated DNase，CAD)、凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF) 和核酸内切酶G (endonuclease G，Endo G)。CAD由caspase激活，可进入细胞核内，致DNA片断化;AIF、Endo G均由线粒体释放，以非caspase依赖性方式介导染色质浓集及DNA片断化。王焕明等[13]对颞叶癫(疒间)病人活体标本及非颞叶癫(疒间)病人尸解标本进行对比研究，同样观察到颞叶癫(疒间)病人海马CA3区末端标记阳性细胞平均百分率显著性增高，说明DNA裂解片段增多，提示细胞中存在效应酶介导的DNA裂解过程。Schindler等[14]对颞叶癫(疒间)与非癫(疒间)病人的海马标本进行对比，发现海马中这些效应酶呈亚细胞分布，细胞核内CAD显著表达;同时用半定量免疫组化分析法在病人标本中发现了裂解的caspase-3阳性细胞，而对照组呈阴性。 颞叶癫(疒间)病人线粒体中的AIF、Endo G含量也显著性高于对照组，且仅在裂解caspase-3阳性细胞的细胞核内检测出AIF的存在，在病人的细胞核中并没有发现Endo G蓄积。这些材料从直接导致DNA断裂的酶水平充分证明了正在发生的凋亡，同时也提示，可将干预凋亡发生作为癫(疒间)治疗的一个手段。

　　2.3 凋亡调节蛋白的研究 最早对凋亡调节蛋白的研究是对Bcl-2家族分子的研究。Bax是一种重要的促细胞凋亡分子，它可以结合成同源二聚体，作为线粒体膜上离子通道的组成成分，使CytC穿过线粒体膜，导致线粒体依赖型凋亡的发生[15]。Bcl-2则可与Bax竞争结合，形成异源二聚体，封闭Bax形成的通道，防止CytC释放，从而抵抗细胞凋亡[16]。庞琦等[17]研究了24例难治性颞叶癫(疒间)病人的海马前部组织，并与6例颞叶前部脑血管畸形病人进行对比，通过免疫组化方法发现了Bcl-2蛋白的差异性表达，同时通过电镜在颞叶癫(疒间)海马标本中观察到了凋亡细胞。Akcali等[18]在动物实验模型海马中检测到了Bax蛋白的表达，同时也在CA1区检测到Bcl-2蛋白含量增加，提示在颞叶癫(疒间)病人中存在凋亡调节蛋白异常表达。P53可以通过诱导氧化还原相关基因表达产生活性氧，促进细胞凋亡，也可以作用于DR5，通过caspase介导的蛋白水解作用导致细胞凋亡。在动物实验模型中已经证实：癫(疒间)发作可以诱导p53基因的表达[19]。

　　Bcl-2家族成员主要是外源性凋亡途径的调节分子，近年来， Henshall等[20]采用活体标本对照实验研究，发现了另外一种调节蛋白DAP激酶——DAP与FADD结合物的存在，提示DAP激酶可能通过作用于FADD调节凋亡的发生;同时通过共免疫沉淀分析，发现DAP激酶与DIP-1是联合表达的。作者第1次提出DAP激酶、DIP-1在颞叶癫(疒间)病人海马病灶中存在表达，且在内源性神经元凋亡途径中具有调节蛋白的作用;这种结合物在动物实验中也得到了证实[21]。

　　3 凋亡基因水平的研究

　　一些学者甚至在基因水平找到了颞叶癫(疒间)海马损伤神经元存在凋亡机制的证据，如Akcali等[18]在颞叶癫(疒间)动物模型海马CA1区检测到编码Bax、Bcl-2蛋白的mRNA呈异常表达;Lee等[22]在红藻氨酸盐诱导的癫(疒间)模型海马神经元中发现了早期即刻基因的大量表达，如 c-Jun、c-fos，并通过免疫组化定量分析，及用TUNEL检测细胞凋亡，证实早期即刻基因的表达与凋亡细胞数目呈正相关;赵瑞等[23]在国内首次构建了癫(疒间)模型大鼠海马凋亡神经细胞最多时 (即发作终止后72 h) 的海马神经元细胞cDNA文库，其文库中包含了癫(疒间)所致凋亡神经细胞的大量蛋白信息。以caspase-3诱饵蛋白载体pBridge-P17mP12对癫(疒间)模型大鼠海马组织的cDNA文库进行筛选，通过3个酵母基因HIS、ADE、LacZ的检测，并借助DNA测序分析，得到阳性克隆MIZ1 (Msx2相互作用锌指蛋白)，该蛋白含有3个被caspase-3识别并酶切的四肽结构，说明MIZ1是caspase-3新的酶切底物，从而在基因水平说明了凋亡在颞叶癫(疒间)海马神经元死亡中的重要作用。

　　4 凋亡机制研究引发的抗凋亡治疗研究

　　新近的动物实验治疗研究表明：抽搐诱导的神经元丢失可以直接导致癫(疒间)的发生[24]，促使癫(疒间)症状加重[21];凋亡对神经元丢失起到了不可或缺的作用，抗凋亡可能是治疗颞叶癫(疒间)一种新的发展方向。2004年，徐元等[25]采用戊四氮致(疒间)模型，在大鼠癫(疒间)发作后连续给予80 mg•kg-1•d-1和40 mg•kg-1•d-1托吡酯，并将未使用托吡酯的癫(疒间)大鼠作为对照，通过TUNEL方法标记DNA断裂片段，原位检测海马CA1和CA3区的神经元，结果显示：80 mg组海马受损神经元明显减少，而40 mg组与对照组差异无统计学意义;说明托吡酯对癫(疒间)发作后的神经元凋亡具有一定保护作用。Gober等[26]对致(疒间)动物模型的海马细胞进行培养，研究人合胞病毒Ⅱ分泌的抗凋亡蛋白ICP10PK的作用机制，应用含有蛋白ICP10PK的无毒性病毒体DeltaRR和ICP10PK敲除的DeltaPK病毒体分别感染培养中的神经元细胞，结果发现：携带蛋白ICP10PK的DeltaRR能抑制caspase-3的活性作用，减少神经元细胞发生凋亡。Manno等[27]发现：在癫(疒间)模型动物海马内注射肉毒杆菌神经毒素E能阻止神经元丢失，其机制是下调了磷酸化c-Jun蛋白和caspase-3裂解片段的浓度，从而得出结论，即在海马区注射肉毒杆菌神经毒素E可以阻止海马神经元的凋亡级联反应。Chuang等[28]将颞叶癫(疒间)大鼠模型海马区CA3区神经元细胞为研究对象，探讨一氧化氮合酶Ⅱ (NOSⅡ) 的促凋亡作用，研究结果显示：NOSⅡ、CytC、启动caspase-3、DNA裂解片段逐步表达并呈相关性，未检测到NOSⅠ、NOSⅢ;应用NOSⅡ抑制剂进行进一步研究，可以检测到CytC、启动caspase-3、DNA裂解片段减少，而NOSⅠ、NOSⅢ抑制剂均未起效。该结果充分说明：NOSⅡ抑制剂可以扭转凋亡发生。

　　在以上动物实验中，抗凋亡物质的作用机制均为对凋亡分子或凋亡调节蛋白起作用，提示以凋亡途径相关分子为靶点的抗凋亡药物研究是可行的。

　　5 小结及展望

　　总之，颞叶癫(疒间)海马神经元中存在癫(疒间)发作-死亡受体表达-效应酶介导凋亡，以及凋亡调节蛋白调节海马神经元死亡的凋亡机制;其可能与颞叶癫(疒间)海马病理变化乃至癫(疒间)病情加重有关。大量的分子生物学研究已为癫(疒间)药物研究提供了前景，并为抗癫(疒间)治疗研究点燃了希望。但研究仍仅限于动物实验，尚未发现针对活体标本的凋亡外源途径研究，且各种途径间的相互联系以及凋亡与癫(疒间)的发作类型、频率、病程长短的关系等亦无报道;此外，在动物实验中发现了细胞坏死现象的存在，其与凋亡的关系尚不明确。这些问题均有待进一步研究，抗凋亡治疗应用于临床，仍有很长的路要走。

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