脑肿瘤干细胞

　　作者：汤旭群　　作者单位：复旦大学附属华山医院神经外科， 上海 200040

　　【摘要】脑肿瘤组织中的细胞在表型和形态功能上呈现多样性，部分肿瘤细胞表面同时表达神经元和胶质细胞的标记，表明脑肿瘤可能起源于一种多潜能干细胞。作为脑肿瘤的可能起源细胞，脑肿瘤干细胞 (BTSC) 的产生与神经干细胞 (NSC) 关系密切。本文对BTSC的体内外实验结果、可能产生机制及今后的研究方向等进行综述，着重讨论BTSC的进一步纯化、分离及其形成肿瘤的分子机理等。

　　【关键词】 肿瘤干细胞 神经干细胞 脑肿瘤

　　脑肿瘤 (特别是恶性脑肿瘤) 具有浸润性生长、易复发和播散转移的特点，成为神经外科的治疗难题。以往关于脑肿瘤的研究主要局限在传统的组织病理学方面，很少针对肿瘤组织中瘤细胞表型和功能多样性的本质进行研究，收效甚微。近年来，随着神经干细胞 (NSC) 的研究取得一定进展[1]，造血系统肿瘤和乳腺癌中肿瘤干细胞的成功分离和证实[2～4]，一些脑肿瘤研究者相继提出了脑肿瘤干细胞 (BTSC) 的概念，认为脑肿瘤中确实存在着一小群细胞，在脑肿瘤的发生、发展和复发方面起决定性作用。

　　1 BTSC的提出和存在依据

　　脑肿瘤组织中的细胞在表型和形态功能上呈现多样性和异质性，包括未分化和分化细胞，部分肿瘤细胞表面同时表达神经元和胶质细胞的标记，表明脑肿瘤可能起源于一种多潜能神经干细胞[5]。有些恶性脑肿瘤即使瘤体切除或者放、化疗后，也会在一定时间内复发和转移，提示脑肿瘤可能起源于一种特殊的细胞群，这些细胞具有自我更新增殖和分化成相应成熟瘤细胞的能力。目前文献报道了不少体内和体外的实验研究[6～11]，证实了脑肿瘤组织确实存在着这种细胞，由于它们的特性与NSC有着惊人的相似性，因而称为BTSC。

　　1.1 BTSC存在的体外实验研究 Ignatova等[6]最早报道了关于BTSC的体外分离和培养结果。他们将手术取得的胶质瘤标本制成细胞悬液，在NSC培养条件下 (无血清，无细胞黏附，加入表皮生长因子和成纤维细胞生长因子) 进行培养，结果发现l0个胶质瘤标本中8个培养出了悬浮生长的球样结构，称为脑肿瘤球。肿瘤球细胞中NSC标记物nestin为阳性，神经元β-Ⅲ微管蛋白和神经胶质细胞纤维酸性蛋白 (GFAP) 单独或同时表达，提示这类细胞具有NSC特性和双向 (神经元和星形细胞) 分化能力。他们把这类细胞称为肿瘤干细胞样细胞。Singh等[7]在主要是髓母细胞的脑肿瘤中，同样发现部分肿瘤细胞可形成神经球样脑肿瘤球，也表达nestin和另外一种NSC标记物CD133，其具有自我更新和增殖能力，并且比NSC更强，他们称之为BTSC。BTSC在NSC离体分化条件下，可分化为与来源肿瘤表型相同的肿瘤细胞，从神经元和 (或) 星形细胞肿瘤中分离的BTSC在分化后仍具有神经元和 (或) 星形细胞的性状，提示BTSC可能是肿瘤细胞的起源细胞。继而Hemmati等[8]用相似的方法在儿童脑肿瘤，主要是髓母细胞瘤和恶性胶质瘤中分离出一种所谓肿瘤来源的前体细胞，具有与上述细胞相似的生物学特性：形成肿瘤球和分化为与来源肿瘤表型相同的肿瘤，并能表达多个干细胞特异性基因，如nestin，CD133，musashi-1 (NSC)，bmi-1等;提示其为一种较原始的干细胞。此外，Kondo等[9]同样从C6胶质瘤细胞系中成功地培养出了肿瘤球，并且符合肿瘤干细胞的相关特性。体外的实验证据表明：①脑肿瘤中存在BTSC，在NSC培养条件下能形成类似神经干细胞神经球样的结构，称为肿瘤球，具有很强的自我更新和增殖能力。②BTSC表面能表达NSC的标记分子，如nestin，CD133，musashi-1 (NSC)，bmi-1等。③BTSC在体外NSC诱导分化条件下能分化为与来源肿瘤表型相同的肿瘤。

　　1.2 BTSC存在的体内实验研究 与体外实验相比,BTSC的体内实验研究更能够说明其在肿瘤起源和发生机制上的重要作用。Hemmati等[8]将分离得到的肿瘤来源的前体细胞移植到新生大鼠脑内，结果显示：其分化为神经元和胶质细胞，并且增生至少4周，提示其具有自我更新和多潜能分化特性。Galli等[10]利用CD133作为标记物，从多形胶质母细胞瘤标本中分别收集CD133阳性和阴性细胞，然后接种至严重联合免疫缺陷 (SCID) 鼠的颅内、腹腔和皮下，结果发现CD133阴性细胞无致瘤能力，而CD133阳性细胞的致瘤率从50%～100%不等。Singh等[11]同样将瘤细胞接种至SCID鼠脑组织中，结果发现CD133阳性细胞具有极强的致瘤能力，接种量降至102数量级仍可形成肿瘤;相反，接种CD133阴性细胞升至105数量级仍未形成肿瘤，仅在接种处形成组织瘢痕。此后，他将接种成功的脑肿瘤切除后制成细胞悬液，按相同的方法培养、分离出干细胞，然后再次行颅内接种，结果在SCID鼠脑组织中形成了同样的肿瘤灶。如此重复5次，均获得了相同结果。另外将干细胞接种鼠脑获得的瘤块与亲本肿瘤进行比较，发现亲本肿瘤与其干细胞生成的肿瘤非常相似，髓母细胞瘤干细胞接种后，瘤细胞小而圆，细胞核深染;多形性胶质母细胞瘤干细胞接种后，瘤细胞表现出多形性，肿瘤血管很丰富。免疫组化染色表明：髓母细胞瘤干细胞接种的肿瘤与亲本肿瘤均表达反映未分化状态的标记物nestin和神经元标记物β-Ⅲ微管蛋白;而多形性胶质母细胞瘤干细胞接种的肿瘤和亲本肿瘤均表达nestin和胶质细胞标记物GFAP等。而当髓母细胞瘤亲本肿瘤表达GFAP时,其干细胞移植接种的肿瘤才表达GFAP。这些肿瘤干细胞的体内移植接种实验结果表明了肿瘤组织内的BTSC在体内仍具有很强的自我更新和增殖能力;与NSC的分化不同的是，BTSC在体内分化为与亲本肿瘤相同的表型,而不是象NSC一样按比例地分化成神经元和胶质细胞[12]。

　　2 BTSC的可能产生机制及其依据

　　关于脑肿瘤起源细胞的研究由来已久，有学者曾提出脑肿瘤可能起源于位于室管膜下区的NSC[13]。近年来随着NSC研究的深入和BTSC从各种脑肿瘤 (特别是恶性脑肿瘤) 中成功分离，发现BTSC与NSC有着惊人的相似特性，于是学者进一步提出了脑肿瘤起源的NSC假说，即在特定的条件下，NSC发生基因突变，积累到一定程度，向BTSC或其前体细胞转化，BTSC再分化为各种肿瘤组成细胞，最终形成肿瘤。目前有许多理论和实验依据可以支持这一观点：①BTSC和NSC存在许多相似处，如目前BTSC的分离、培养和分化条件与NSC相同，它们均表达相同的细胞表面标记分子 (如nestin，CD133，musashi-1，bmi-1等)，BTSC和NSC在体外相同的培养条件下均能形成神经球样结构，具有自我更新和分化为相应成熟细胞的能力。肿瘤细胞与NSC在信号转导方面也有很多相似[14]。这些路径包括hedgehog (hh)、Wnt、Bmi-l等，它们在调节干细胞生长方面具有重要作用，同时与肿瘤发生也有着密切的关系。正常情况下这些信号途径与神经发育和生长有关，但一旦这些信号分子基因突变后，NSC的自我更新和分化发生失衡，突变积累到一定程度，NSC就转变为持续增殖的BTSC，进而产生肿瘤。有文献报道在胶质瘤中有hh基因表达异常，抑制其表达可以抑制肿瘤细胞生长，提示其与胶质瘤生长有关[15];某些髓母细胞瘤中存在Wnt组成因子的突变[16]。②单一细胞经4～7次突变就有可能发生恶性转变，组织更新越快，复制、转录过程中发生基因突变的概率就越高。NSC是中枢神经系统最活跃的细胞，长期处于分裂、增殖状态，容易发生突变，因此突变的NSC相对于已分化细胞而言更有可能转变为BTSC[5]。③有实验研究证实了突变后的NSC具有致瘤性。Holland等[17]用逆转录病毒系统，将癌基因分别导入GFAP和nestin阳性细胞，观察它们致瘤的情况，结果发现nestin阳性细胞发生肿瘤概率大。另外Aboody等[18]研究发现：NSC有向脑肿瘤组织趋化的特性。这些实验结果对BTSC可能来源于正常NSC提供了事实依据。④有研究证实某些肿瘤的起源部位位于脑室周围，与近年来研究的NSC分布区域一致。Uchida等[19]报道了1例星形细胞瘤起源于室管膜下区的NSC。某些致瘤实验也发现脑室周围较皮质肿瘤发生率高。

　　3 BTSC研究的意义和今后研究的方向

　　BTSC概念的提出为脑肿瘤的发生、发展及复发机制研究提供了新的探索方向，其研究成果必将对脑肿瘤的临床诊断、治疗和预后产生重要意义。研究发现从恶性程度不同的肿瘤组织中，分离得到的BTSC比例不同，且肿瘤恶性程度越高，肿瘤干细胞所占的比例越大，可以设想今后肿瘤干细胞的检测将成为脑肿瘤新分类和判断预后的依据。BTSC虽然只占脑肿瘤细胞中的一小部分，但其自我更新和分化的失衡引起了脑肿瘤的发生、发展和复发，据此，今后脑肿瘤的治疗目标将转向如何消灭BTSC，而不是所有的瘤细胞。上面提到NSC的突变积累到一定程度转变为BTSC，BTSC再分化为各种肿瘤组成细胞，最终形成肿瘤。对NSC如何变为BTSC环节的分子机理研究无疑将有助于寻找针对BTSC的治疗靶点。关于BTSC为什么分化成与亲本肿瘤有相同表型的瘤细胞，而不是像NSC那样按比例的分化为神经元和胶质细胞这一问题的阐述，将指引脑肿瘤研究者利用诱导分化的方法使BTSC向良性分化，从而根治肿瘤。

　　尽管目前BTSC的分离培养方面取得了很大的进展，但BTSC的特异性标记仍未找到，目前分离和鉴别BTSC的标记主要是NSC的细胞表面标记物，如nestin，CD133等。然而基于BTSC在生物学及遗传学上的差异性，BTSC与NSC肯定存在着细胞表面分子表达上的差异，只是至今尚未发现。寻找BTSC的特异性标记物是深入研究BTSC的前提，无疑将成为今后该研究领域的重要课题。此外，BTSC很可能来源于突变的NSC，那突变的基因是什么，发生了怎样的突变以及突变后所产生的分子事件和分子机理是怎样的，这些均将成为围绕BTSC研究的新方向。目前已经初步知道BTSC和NSC在调控机制上有共同的分子信号传导途径，并且知道BTSC在信号分子上发生了基因突变，但到底它们发生了什么样的变化，各自在其中又扮演了什么样的角色，这将是脑肿瘤研究的热点和关键，必将有助于阐明脑肿瘤发生的分子机制,指导以后的治疗。

　　综上所述，理论和实验均支持BTSC很可能来源于处于不断分裂增殖状态的突变NSC。虽然BTSC与NSC有着很多的相似点，它们之间也有差异：BTSC的自我更新和增殖能力比NSC强，离体培养的传代次数明显增多，有永生化趋势，其自我更新和分化发生了失衡;BTSC在诱导NSC分化的条件下分化为与亲本肿瘤相同的表型而不像NSC一样按比例分化成神经元和胶质细胞。这些差异性为今后研究NSC如何转化成BTSC，期间到底发生了怎样的分子事件，BTSC与NSC是否处于同一分化层次还是NSC分化成的一种前体细胞等提供了线索。

　　【参考文献】

　　[1] 李晓燕. 神经干细胞和脑肿瘤干细胞与胶质瘤发生发展潜在性研究 [J]. 实用肿瘤杂志, 2005; 20(4): 356-359.

　　[2] Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell [J]. Nat Med, 1997; 3(7): 730-737.

　　[3] Hope KJ, Jin L, Dick JE. Acute myeloid leukemia originates from a hierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity [J]. Nat Immunol, 2004; 5(7): 738-743.

　　[4] Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003; 100(7): 3983-3988.

　　[5] Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells [J]. Nature, 2001; 404(6859): 105- 111.

　　[6] Ignatova TN, Kukekov VG, Laywell ED, et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro [J]. Glia, 2002; 39(3): 193-206.

　　[7] Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors [J]. Cancer Res, 2003; 63(18): 5821-5828.

　　[8] Hemmati HD, Nakano I, Lazareff JA, et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003; 100(25): 15178-15183.

　　[9] Kondo T, Setoguchi T, Taga T. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line [J]. Proct Natl Acad Sci USA, 2004: 101(3): 781-786.

　　[10] Galli R, Binda E, Orfanelli U, et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma [J]. Cancer Res, 2004; 64(9): 7011-7021.

　　[11] Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al. Identification of human brain tumour initiating cells [J]. Nature, 2004; 432(7015): 396-401.

　　[12] Galli R, Gritti A, Bonfanti L, et al. Neural stem cells: an overview [J]. Circ Res, 2003; 92(6): 598-608.

　　[13] Recht L, Jang T, Savarese T, et al. Neural stem cells and neuro-oncology：quo vadis [J]? Cell J Biochem, 2003; 88(1): 11-19.

　　[14] Oliver TG, Wechsler-Reya RJ. Getting at the root and stem of brain tumors [J]. Neuron, 2004; 42(6): 885-888.

　　[15] Dahmane N, Sanchez P, Gitton Y, et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis [J]. Development, 2001; 128(24): 5201-5212.

　　[16] Wechsler-Reya RJ. Analysis of gene expression in the normal and malignant cerebellum [J]. Recent Prog Horm Res, 2003; 58: 227-248.

　　[17] Holland EC, Celestino J, Dai C, et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice [J]. Nat Genet, 2000; 25(1): 55-57.

　　[18] Aboody KS, Brown A, Rainov NG, et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: Evidence from intracranial gliomas [J]. Proc Nat1 Acad Sei USA,