脑通灵对大鼠脑缺血再灌注BaxmRNA表达变化的影响

　　作者：陈晓春 作者单位：(河北北方学院附属第一医院神经内科，河北 张家口 075000) 河北省科学技术研究与发展指导计划项目(编号：072761916)

　　【摘要】 目的：观察脑通灵对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响。方法：应用动脉栓线法建立脑缺血再灌注损伤大鼠模型，采用BaxmRNA原位杂交技术，观察阳性细胞，经图像分析，并测定脑组织超氧化物歧化酶活性(SOD)和丙二醛(MDA)含量。结果：脑通灵治疗组与模型对照组比较，阳性细胞表达减弱，SOD活性高，MDA含量减低，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：脑通灵通过抑制促凋亡基因BaxmRNA和清除自由基，对脑缺血再灌注损伤有保护作用。

　　【关键词】 基因;脑通灵;自由基;脑;缺血再灌注损伤;BaxmRNA;大鼠

　　Neuron Configuration and Expression of BaxmRNA

　　after Cerebral Ischemia Reperfusion and Effect of Naotongling in Rats

　　CHEN Xiaochun

　　The First Affiliated Hospital,Hebei North University,Zhangjiakou，075000,Hebei,China

　　【ABSTRACT】 Objective:To observe the protective effect of Naotongling on ischemia reperfusion injury in rat.Methods:The modified Bannister method was used to make the modle of focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats to study the effect of Naotongling on BaxmRNA in cerebral cortex in the modle rats.Results:Naotongling decreased average numerial and increased average gray value,there was obvious difference between the groups(P<0.05).Conclution:Nao tong ling has a protective effect on rat brain damage induced by focal cerebral ischemia reperfusion.

　　【KEY WORDS】 Genes,Naotongling,Free radicals,Brain,Reperfusisn injury,BaxmRNA,Rats

　　随着社会环境因素和饮食结构的改变，人类脑血管病的发病率日益增加，其中缺血性脑血管病占80%以上[1]。本实验用BaxmRNA原位杂交技术，DAB显色，光镜观察细胞浆呈棕黄色为阳性细胞。经图像分析阳性细胞的多少，观察自制脑通灵对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 BaxmRNA原位杂交检测试剂盒由武汉博士德生产。MDA、SOD测定试剂盒由南京建成生物研究所生产。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型制备及分组

　　健康雄性wistar大鼠36只，体重200～240g，随机分为正常对照组(N)，模型对照组(M)，脑通灵治疗组(TMP),每组12只。应用Koizumi[2]栓线法建立脑缺血再灌注大鼠模型，大鼠麻醉后，固定大鼠于手术台上，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉、右侧颈外动脉及其分支，在近颈总动脉分叉约3mm处剪一个小口，用动脉栓线插入颈内动脉约(18±0.5)mm，遇轻微阻力后，结扎颈内动脉，再灌注时只需将栓线抽出。动物清醒后至少具备同侧Horner征，提尾时对侧前肢内收屈曲者为造模成功。缺血90min后，拔出栓线再灌注120min。脑通灵治疗组分别于梗塞前及再灌注前5min灌胃给药2mL;模型对照组腹腔注射等量生理盐水;正常对照组仅手术暴露血管。

　　1.2.2 标本采集和处理

　　各组均断头取脑，在脑的视交叉后和下丘脑后横断(冠状面)将脑分成前、中、后三部分，在前、中切面上，取1.5mm厚脑片用于光镜切片。

　　1.2.3 脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测量 将大鼠断头取脑，去离子水冲静表面，取视交叉与脚间窝间切片约200～300mg，用SOD、MDA试剂盒和721分光光度计测定。

　　1.2.4 BaxmRNA原位杂交具体操作按说明书进行。

　　1.2.5 图像分析

　　利用北航提供的灰度及数密度分析软件,对原位杂交后切片进行计算机图像分析,所有切片均在同一放大倍数(×400)下分析,以胞质着色深度代表mRNA含量的变化,灰度值越小,说明其阳性细胞多(即mRNA含量高),反之灰度值大则说明其阳性细胞少(mRNA含量低)。

　　1.3 中药方剂组成、制备及给药方法

　　(1)脑通灵液方剂组成：黄芪、当归、地龙、川芎、桂枝、通草等。(2)制备：常规煎煮两次，再将两煎的上清液混合，文火煎浓缩至70mL。

　　1.4 统计学分析

　　实验数据用(x±s)表示,采用SPSS10.0软件进行统计学分析。将数据输入先进行单因素方差齐性检验,若方差齐(本组资料全部方差齐)。采用方差分析,组间比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　表1 脑缺血再灌注后大脑皮质MDA、SOD表达注：与模型对照组相比*P<0.01表2 脑缺血再灌注损伤后大脑皮质BaxmRNA的表达(阳性细胞密度)(×103/μm3)(x±s)注：与正常对照组相比*P<0.05;与模型对照组相比#P<0.05表3 脑缺血再灌注损伤后大脑皮质BaxmRNA的表达(平均灰度值注：与正常对照组相比*P<0.01;与模型对照组相比#P<0.05

　　3 讨论

　　缺血性脑血管病严重危害人类身体健康,其发病机理错综复杂,在临床上初次卒中的病例占中、大脑中动脉阻塞很大比例。本实验制作脑缺血再灌注动物模型,同时缺血90min后再灌注,此模型模拟的病理过程与临床卒中很相似。Bax基因在细胞内膜、细胞浆和细胞核均有分布[3]，Bax基因在凋亡发生过程中，起重要枢纽作用[4]。一般说来,在胞质中Bax以单体形式存在,然而在细胞发生凋亡时,与线粒体关联的Bax既可能以无活性的单体形式存在，也可以与线粒体膜结合的大分子量的活性复合物形式存在。当Bax同源二聚体形成,便促进细胞凋亡。自由基攻击细胞膜，改变细胞膜的通透性，打开电压依赖性钙通道，促使兴奋性神经递质谷氨酸和天冬氨酸的释放，打开了受体依赖性钙通道，使细胞外钙离子内流。此外，自由基引发的脂质过氧化造成细胞成份间的义联，使整个神经元丧失了功能。本实验采用原位杂交技术观察到模型对照组BaxmRNA呈强阳性表达，较正常对照组差异有显著性意义(P<0.01)，说明Bax基因在CIR中表达增强，促进神经细胞的凋亡。脑通灵治疗组与模型对照组比较皮质神经元BaxmRNA表达减弱，说明脑通灵可能通过干预促调亡基因表达和清除自由基而发挥治疗作用。脑通灵是在“当归四逆汤”和“补阳还五汤”的基础上加减化裁而成，全方具有益气养血、活血化瘀、温经通脉、通脉健脑的功效，对多种心脑血管病有很好的疗效。

　　【参考文献】

　　1 Mayer TE,Hamann GF,Baranczyk J,et al.Dynamic CT perfusion imaging of acute stroke[J].AJNR,2000,21(8):14411449

　　2 Kuge Y，Minematsu K，Yamaguchi J,et al.Nylon monofilament forintraluminal middle cerebral artery occlusion in rats[J].Stroke,1995,26(9):1655

　　3 Hoetelmans R,van Slooten HJ,Keijzer R,et al.Bcl2 and Bax protein arepreent in interphase nuclei of mammalian cells[J].Cell death differ,2000,7:384392

　　4 曹智刚，袁守军.抑制Bax基因表达与细胞保护的研究进展[J].中国临床药理学与治疗学，2003，8(3)：245248