MN9D多巴胺能细胞损伤模型的建立基

　　作者：钮洪艳1，2,张学文1,刘淮东1,高殿帅2* 作者单位：(1. 徐州医学院附属淮安市第二人民医院中心实验室，江苏淮安223002;2. 徐州医学院神经生物学研究中心，江苏徐州221002)

　　【摘要】 目的 建立离体多巴胺(dopamin，DA)能神经细胞系MN9D细胞损伤模型。方法 离体细胞培养条件下，于培养液中加入不同浓度6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)作用于MN9D细胞30 min。24 h后，MTT比色法检测MN9D细胞的存活率、Hoechst 33258核染色和流式细胞仪检测MN9D细胞的凋亡变化。结果 6-OHDA以浓度依赖性的方式引起MN9D细胞的凋亡，导致细胞存活率降低。200 μmol/L 浓度的6-OHDA作用30 min、培养24 h后，MN9D细胞的存活率降低至68.8%左右，凋亡率增高至约37.8%。结论 6-OHDA能够引起MN9D细胞的存活率降低，而凋亡率增高，产生类似帕金森病时的DA能神经细胞损伤的表现。

　　【关键词】 多巴胺能神经细胞;6-羟基多巴胺;MN9D细胞;帕金森病

　　Establishment of injury model of dopaminergic MN9D cells

　　NIU Hongyan1, 2, ZHANG Xuewen1, LIU Huaidong1, GAO Dianshuai2*

　　(1. Central Laboratory, The Affiliated Huai′an Second People′s Hospital of Xuzhou Medical College,

　　Huai′an, Jiangsu 223002, China;2. Research Center of Neurobiology, Xuzhou Medical College,

　　Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective To establish the cell injury model of dopaminergic cell line MN9D in vitro. Methods MN9D cells were exposed to different concentrations of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) for 30 min in vitro, and 24 h later, the survival of MN9D cells was detected with MTT chromatometry, and the MN9D cells apoptosis was determined with Hoechst 33258 staining and flow cytometry.Results 6-OHDA caused the apoptosis of MN9D cells in a concentration-dependent manner: the survival rate of cells decreased approximately to 68.8% while the apoptotic percentage of cells increased to 37.8% 24 h after a 30 min exposure to 200 μmol/L 6-OHDA. Conclusion 6-OHDA could induce an decrease in the survival rate of MN9D cells and an increase in their apoptosis percentage, causing an injury to MN9D cells in vivo in a form similar to the injury model of dopaminergic neurons in Parkinson′s disease (PD).

　　Key words: dopaminergic cells; 6-OHDA; MN9D cells; Parkinson′s disease

　　帕金森病(Parkinson′s disease, PD) 是以中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺(DA)能神经细胞进行性退变为主要病理特征的神经系统疾病。PD模型是PD基础研究的重要前提。通过大脑立体定位注射神经毒物6-羟基多巴胺(6-OHDA)或腹腔注射甲基苯基四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)是制作PD模型的常用方法。MN9D细胞是一种由胚胎小鼠中脑顶盖的DA能神经细胞和 N18TG2神经母细胞瘤细胞融合而成的细胞系，由于能够表达酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)，并且能够合成、释放及吸收DA[1-3]，因而被广泛应用于DA能神经细胞损伤模型的研究，这些细胞也用于PD与DA能神经元丧失有关的机制及治疗的研究[4]。6-OHDA是一种神经毒素，由于其结构与DA类似，常被误作为神经递质摄入到神经元内，通过启动细胞内凋亡途径而选择性引起DA能神经细胞死亡、缺失[5-6]。目前，应用MN9D细胞建立离体条件下DA能神经细胞的损伤模型，经网上搜索国内未见此类研究文献。本研究在离体细胞培养条件下，于培养液中加入不同浓度的6-OHDA作用于MN9D细胞30 min，24 h后，观察MN9D细胞的存活率、凋亡率及与6-OHDA作用浓度的关系，选择适当的6-OHDA浓度，建立稳定的离体细胞损伤模型，以产生类似于PD细胞内损伤的形式。

　　1 材料和方法

　　1.1 MN9D细胞和试剂 MN9D细胞由首都医科大学惠赠。DMEM/F12、胎牛血清、6-OHDA、维生素C、MTT、Hoechst 33258染色剂和金属离子螯合剂(diethylenetriamine pentaacetic acid, DETAPAC)购自Sigma公司，AnnexinV- FITC / PI凋亡试剂盒购自博蕴生物试剂有限公司。

　　1.2 MN9D细胞培养 MN9D细胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液培养，并且含有1×105 U/L青霉素及100 g/L链霉素。常规复苏MN9D细胞，传2～3代后应用于实验。将细胞消化、传代，以1～5×108/L接种于所需的培养板中，置37℃、5%CO2平衡湿度的标准培养箱内培养。

　　1.3 6-OHDA的配制和处理 应用含0.15%维生素C和金属离子螯合剂(DETAPAC, 10 mmol/L)的无菌水配制浓度为10 mmol/L的6-OHDA母液[7]。细胞接种于所需的培养板中，在给予6-OHDA处理前培养液更换为无血清的培养基。6-OHDA母液被进一步稀释，在培养液中的终浓度为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 μmol/L，加入到各个孔中，并设正常对照组(Control group)和溶剂对照组(Vehicle group)。正常对照组不予任何处理，溶剂对照组仅给予等量用于配制6-OHDA的维生素C和金属离子螯合剂的无菌水。30 min后，以无血清的培养液洗细胞2次，更换含血清的DMEM/F12继续培养24 h[8]。

　　1.4 MTT比色法检测细胞存活率 细胞接种于96孔板给予不同处理，各组细胞继续培养24 h后每孔加入20 μl MTT(5 g/L、PBS配制)。继续培养4 h后仔细吸去所有液体，加入200 μl二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO)充分溶解，37℃静置0.5 h。酶标仪570 nm检测光密度(D)值，计算细胞存活率(即每组D值/正常对照组D值×100%=该组的细胞存活率)。

　　1.5 Hoechst 33258核染色观察凋亡细胞形态 细胞接种于24孔板，细胞培养及6-OHDA的处理同上。24 h后吸去培养液，每孔加入200 μl 3.7%的甲醛(PBS配制，现配现用)，室温固定20 min。吸去固定液，PBS洗细胞2次。每孔加入100 μl的Hoechst 33258染液(10 mg/L、PBS配制)，室温避光染色5～15 min，在20×10倍显微镜下每组选择5个视野计数，计算细胞凋亡率，注意避开培养孔的四周区域。

　　1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率 细胞接种于6孔板，细胞培养及6-OHDA的处理同上。24 h后吸去培养基，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗细胞2次，每管加入0.5 ml AnnexinV- FITC / PI凋亡试剂盒中的1×annexin结合缓冲液重悬细胞，将重悬的细胞转移到专用试管内。每管加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI。室温避光5 min，上机检测MN9D细胞凋亡率。

　　1.7 统计学处理 所有数据以±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,每组数据至少从3次独立的实验中获得,组间比较采用最小显著差(LSD)法，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度6-OHDA处理对MN9D细胞存活率的影响 MTT法检测结果显示，MN9D的存活率与6-OHDA的损伤作用呈浓度依赖性关系，随着 6-OHDA浓度的增加MN9D细胞的存活率逐渐下降(表1)。不同浓度的6-OHDA组与正常对照组比较，差异均有统计学意义，而溶剂对照组与正常对照组之间差异无统计学意义。表1 6-OHDA对MN9D细胞存活率的影响(n=5)与正常对照组比较：*P<0.01

　　2.2 不同浓度6-OHDA引起MN9D细胞凋亡的变化 Hoechst 33258核染色结果显示，随着6-OHDA浓度的增加，具有凋亡形态的MN9D细胞逐渐增加(图1)。凋亡的细胞核固缩、碎裂，荧光显微镜下可见浓染致密的颗粒状荧光(如箭头所示)。经统计学处理，各浓度6-OHDA组的细胞凋亡率与正常对照组比较，差异均有统计学意义，而溶剂对照组与正常对照组之间差异无统计学意义。

　　AnnexinV- FITC / PI双染流式细胞仪检测结果与Hoechst 33258核染色结果相似(图2)。 图1 不同浓度6-OHDA对MN9D细胞凋亡的影响(Hoechst 33258核染色，Bar=20 μm)

　　A.正常对照组;B.溶剂对照组;C～L依次为100～1 000 μmol/L 6-OHDA组; 与正常对照组比较：*P<0.01

　　图2 不同浓度6-OHDA对MN9D细胞凋亡影响的流式细胞仪分析结果

　　A.正常对照组;B.溶剂对照组;C～L分别为100～1 000 μmol/L 6-OHDA组; 与正常对照组比较：*P<0.01

　　3 讨 论

　　MN9D细胞系具有在体多巴胺能神经细胞的某些特性，如TH表达阳性，能够吸收、合成及释放DA等，因此被广泛应用于制作DA能神经细胞损伤的模型。6-OHDA是一种神经毒素，能够特异性地引起DA能神经细胞的损伤，也常应用于PD模型的制作。本研究应用不同浓度的6-OHDA作用于MN9D细胞，观察MN9D细胞存活率和凋亡率的变化，以期发现能够引起一定数量细胞凋亡的最佳浓度，为进一步的研究建立稳定的离体细胞损伤模型。

　　过去文献报道中,通常以DA能细胞慢性暴露于6-OHDA(2～48 h)而建立细胞的损伤模型[9-12]。而最近研究认为，6-OHDA在标准培养状态下5 min内即发生降解，这种降解很有可能产生伴随的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)在培养基中增加。已知较长时间暴露于6-OHDA的原代中脑细胞发生非特异性的损伤。为了产生类似于PD中产生的细胞内损伤形式，6-OHDA应用金属离子螯合剂和抗氧化的维生素C加无菌水配制，并且在加入6-OHDA前应用氮气(N2)冲洗溶剂，这种处理可以极大地抑制6-OHDA的降解达30 min[8]。因此，在我们的实验中，一方面按照上述方法配制6-OHDA，另一方面限制6-OHDA的暴露时间为30 min，以确保6-OHDA对MN9D细胞的损伤作用是细胞内产生ROS的结果，而不是一般性的细胞毒性反应[13]。由于6-OHDA这种快速降解的特性，实验中要求现配现用，但是，这样应用不仅费时费力，而且会造成6-OHDA的极大浪费。有文献报道，将6-OHDA按上述方法配制后，省去N2冲洗的过程，迅速分装冷藏置-80℃，通过高效液相色谱-电化学方法(HPLC)检测发现6-OHDA在-80℃可以储存6个月以上[14]，这样6-OHDA的配制和使用则更为方便。

　　在本研究中，我们应用3种独立的方法分别检测6-OHDA对MN9D细胞存活和凋亡的影响。MTT法检测细胞相对的存活率，Hoechst 33258染色能够观察到凋亡细胞核的特征，而AnnexinV- FITC / PI双染流式细胞仪检测可以区分坏死和凋亡的细胞。3种方法检测结果共同说明， MN9D细胞的存活和凋亡与6-OHDA的损伤作用呈浓度依赖性关系，在200 μmol/L 6-OHDA作用30 min、培养24 h后，约37.8%的细胞凋亡，并且，在此作用浓度下我们发现存活的MN9D细胞形态与正常对照组细胞形态相似，显示较好的存活状态，继续按正常培养的方法培养，细胞能够健康生长。当6-OHDA的浓度在300～500 μmol/L时，存活的细胞在损伤后继续培养2～3天约50%出现死亡，而6-OHDA浓度大于500 μmol/L时，尽管仍按正常的方法培养，但是绝大多数细胞在损伤的2～3天后逐渐趋于死亡。因此，为了进一步研究对损伤MN9D细胞的保护作用，我们选择200 μmol/L浓度的6-OHDA建立离体的细胞损伤模型。

　　【参考文献】

　　[1] Choi HK, Won LA, Kontur PJ, et al. Immortalization of embryonic mesencephalic dopaminergic neurons by somatic cell fusion[J]. Brain Res, 1991, 552(1): 67-76.

　　[2] Heller A, Price S, Won L. Glial-derived neurotrophic factor (GDNF) induced morphological differentiation of an immortalized monoclonal hybrid dopaminergic cell line of mesencephalic neuronal origin[J]. Brain Res, 1996, 725 (1): 132-136.

　　[3] Han BS, Hong HS, Choi WS, et al. Caspase-dependent and -independent cell death pathways in primary cultures of mesencephalic dopaminergic neurons after neurotoxin treatment[J]. J Neurosci, 2003, 23(12):5069 -5078.

　　[4] Rick CE, Ebert A, Virag T, et al. Differentiated dopaminergic MN9D cells only partially recapitulate the electrophysiological properties of midbrain dopaminergic neurons[J]. Dev Neurosci, 2006, 28(6):528-537.

　　[5] Liang Q, Liou AK, Ding Y, et al. 6-Hydroxydopamine induces dopaminergic cell degeneration via a caspase-9-mediated apoptotic pathway that is attenuated by caspase-9dn expression[J]. J Neurosci Res, 2004, 77(5):747-761.

　　[6] Martí MJ, Saura J, Burke RE, et al. Striatal 6-hydroxydopamine induces apoptosis of nigral neurons in the adult rat[J]. Brain Res, 2002,958(1):185-191.

　　[7] Ding YM, Jaumotte JD, Signore AP, et al. Effects of 6-hydroxydopamine on primary cultures of substantia nigra: specific damage to dopamine neurons and the impact of glial cell line-derived neurotrophic factor[J]. J Neurochem, 2004,89(3):776-787.

　　[8] Ugarte SD, Lin E, Klann E, et al. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase and MEK[J]. J Neurosci Res, 2003, 73(1):105-112.

　　[9] Grothe C, Schulze A, Semkova I, et al. The high molecular weight fibroblast growth factor-2 isoforms (21,000 mol. wt and 23,000 mol. wt) mediate neurotrophic activity on rat embryonic mesencephalic dopaminergic neurons in vitro[J]. Neuroscience, 2000, 100(1):73- 86.

　　[10] Ibi M, Sawada H, Nakanishi M, et al. Protective effects of 1α, 25-(OH)2D3 against the neurotoxicity of glutamate and reactive oxygen species in mesencephalic culture [J]. Neuropharmacology, 2001, 40(6):761-771.

　　[11] Barkats M, Millecamps S, Bilang-Bleuel A, et al. Neuronal transfer of the human Cu/Zn superoxide dismutase gene increases the resistance of dopaminergic neurons to 6-hydroxydopamine[J]. J Neurochem, 2002, 82(1):101-109.

　　[12] Holtz WA, O′Malley KL. Parkinsonian mimetics induce aspects of unfolded protein response in death of dopaminergic neurons[J]. J Biol Chem,2003,278(21):19367-19377.

　　[13] Lin E, Cavanaugh JE, Leak RK, et al. Rapid activation of ERK by 6-hydroxydopamine promotes survival of dopaminergic cells[J]. J Neurosci Res, 2008,86(1):108-117.

　　[14] Cavanaugh JE, Jaumotte JD, Lakoski JM, et al. Neuroprotective role of ERK1/2 and ERK5 in a dopaminergic cell line under basal conditions and in response to oxidative stress[J]. J Neurosci Res, 2006, 84(6):1367-1375.