大鼠脑缺血再灌注诱导自体神经干细胞原位增殖的研究

　　作者：刘晓帆，冯志博，杨文亮　　作者单位：新乡医学院附属新乡市第一人民医院神经外科， 河南 新乡 453000

　　【摘要】目的 研究缺血性脑损伤对内源性神经干细胞增殖、迁移的影响。 方法 参照Pulsinelli-Brierley法制作短暂性全脑缺血动物模型，全脑缺血10 min后再灌注，采用SABC 免疫组化染色显示5'-溴脱氧尿嘧啶 (BrdU) 阳性细胞和神经巢蛋白 (Nestin) 阳性细胞，光镜下观察并统计分析脑缺血损伤后内源性神经干细胞增殖、迁移的变化过程。 结果 脑缺血再灌流24 h后，海马、齿状回和室管膜下区的BrdU阳性细胞和Nestin阳性细胞增多，7～10 d达到高峰，术后20 d仍有表达;在室管膜下区，BrdU阳性细胞和Nestin 阳性细胞有向皮质、海马迁移的现象。 结论 ①成年大鼠全脑缺血后7～10 d，内源性神经干细胞的增殖达到高峰。②增殖的内源性神经干细胞存在由增殖区向靶区迁移的现象。

　　【关键词】 脑缺血, 再灌注损伤, 干细胞, 巢蛋白, 溴脱氧尿苷

　　In situ proliferation of endogenous neural stem cells after cerebral ischemia reperfusion in rats

　　LIU Xiaofan, FENG Zhibo, YANG Wenliang

　　Department of Neurosurgery, First People Hospital of Xinxiang, Xinxiang Medical College, Xinxiang 453000, China

　　Abstract: Objective To investigate into the proliferation and transference of endogenous neural stem cells after cerebral ischemia injury. Methods An animal model of transient global cerebral ischemia was established by four-vessel occlusion for 10 minutes, followed by reperfusion, as described by Pulsinelli and Brierley. BrdU positive cells and Nestin positive cells were stained by SABC immunohistochemistry. The processes of proliferation and transference of endogenous neural stem cells were observed under light microscope, and the data were analyzed statistically. Results Compared with normal group and sham operated control groups, BrdU positive and Nestin positive cells were increased in the hippocampus, dentate subgranular zone and subependymal zone in operated groups after 24 hours of reperfusion of omni-cerebral ischemia. The expression of BrdU and Nestin reached a peak 7-10 days after the operation, and could still be detected 20 days after the operation. The migration of BrdU positive and Nestin positive cells to the cerebral cortex and hippocampus was observed in subependymal region. Conclusion The proliferation of endogenous neural stem cells reaches a peak 7-10 days after the global cerebral ischemia in adult rats. The proliferative cells trend to migrate from the proliferative zone to the target area.

　　Key words: brain ischemia; reperfusion injury; stem cells; Nestin; bromodeoxyuridine 本研究通过制作短暂性全脑缺血动物模型，采用5-溴脱氧尿嘧啶 (BrdU) 作为DNA合成原料掺入细胞核，通过免疫组化方法显示BrdU阳性细胞 (增殖细胞)和巢蛋白 (neuroepithelial stem protein，Nestin) 阳性细胞 (神经干细胞)，观察缺血性脑损伤后脑内神经干细胞 (NSC) 增殖、迁移的变化过程，探讨内源性NSC在缺血性脑损伤后的变化规律。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 体质量300～350 g的健康雄性SD大鼠62只，由新乡医学院实验动物中心提供;随机分为正常组 (6只)、假手术对照组 (14只) 和脑缺血10 min再灌注 (简称缺血组) 1、3、5、7、10、15、20 d组 (每个时间点6只，共42只)。

　　1.2 试剂与仪器 兔抗大鼠Nestin多克隆抗体、BrdU、小鼠抗 BrdU单克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG、生物素化羊抗小鼠IgG、链霉素-抗生物素蛋白-过氧化物酶 (SABC)、二氨基联甲苯 (DAB) 均购自武汉博士德生物工程有限公司。SD-78型双极电凝器 (上海医用电子仪器厂)，恒冷切片机 (德国，Leica9000)。

　　1.3 短暂型脑缺血模型的制作 采用Pulsinelli-Brierley 方法制作四血管全脑缺血动物模型[1，2]，全脑缺血10 min后再灌注。

　　1.4 增殖细胞标记 缺血组动物于判断模型成功后即刻腹腔注射BrdU 50 mg/kg，以后每4 h注射1次，共3次。假手术对照组于手术次日腹腔注射BrdU，方法与用量同缺血组。到期动物均于取脑时间点的前1 d再行腹腔注射BrdU 50 mg/kg × 3次，每次间隔4 h，并于末次注射12 h后处死动物。SABC法染色。

　　1.5 取材、固定和组织切片制备 到期动物麻醉下以4 ℃生理盐水行快速心内灌注，之后以4%多聚甲醛灌注固定 (4 ℃，0.1 mol/L PBS配制，pH7.4);开颅取脑，4%多聚甲醛中4 ℃固定12 h，随后依次移入20%、30%蔗糖液 (0.1 mol/L PBS配制) 内，4 ℃保存至沉底。连续冷冻冠状切片，片厚40 μm。SABC法染色。

　　1.6 组织学观察、细胞计数及统计学分析 普通光镜下观察各组大鼠同一冠状切面的室管膜下区 (SEZ)、海马CA1区、门区和齿状回的BrdU和Nestin 阳性细胞。在200 × 光镜下取室管膜下区10个不同视野，分别计数每个视野内的BrdU和Nestin阳性细胞，取其平均数作为个体代表值，用x ± s表示。应用SPSS10.0对结果进行统计学分析，显著性标准为P < 0.05。

　　2 结 果

　　2.1 BrdU阳性细胞的光镜观察结果

　　2.1.1 海马、齿状回区： 在正常组与假手术对照组，偶见BrdU阳性细胞。在脑缺血组，1 d组该区域的BrdU阳性细胞即明显增多;之后，BrdU阳性细胞进一步增加，且呈多层排列，并于7 d组达到高峰;至15 d组和20 d组，阳性细胞数目较前减少。

　　2.1.2 SEZ (表1)： 在正常组及假手术对照组，SEZ仅偶见呈卵圆形的BrdU阳性细胞。在脑缺血组，1 d即可见到明显增多的BrdU阳性细胞，细胞呈卵圆形、梭形或哑铃形等，大小不均，排列不规则;3 d组和5 d组，阳性细胞进一步增加，呈团排列，侧脑室背外侧角和腹外侧角SEZ 的BrdU阳性细胞增多更明显，并有向外侧迁移的征象;7 d组，上述部位BrdU阳性细胞增多达到高峰，且明显见到细胞向腹外侧迁移，迁移的细胞群落呈“箭头”状;10 d组，可见到非常密集的BrdU阳性细胞，且细胞迁移现象更加明显 (图1);15 d组和20 d组，BrdU阳性细胞较以前减少，细胞迁移更加广泛和分散。

　　2.2 Nestin阳性细胞的光镜观察结果

　　2.2.1 海马、齿状回区： 在正常组及假手术对照组，仅见零星分布的Nestin阳性细胞，细胞呈卵圆形、三角形或梭形，胞质和突起深染，胞核淡染。在脑缺血组， 从1 d组到10 d组，该区域可见到Nestin阳性细胞逐渐增多，齿状回以7 d组和10 d组Nestin 阳性反应最明显，呈梯度反应模式，离齿状回越近处，反应越明显， Nestin阳性细胞数目越多，齿状回区域的Nestin阳性细胞密集，胞体肥大，伸出长短不一、粗细各异的突起，伸向外周脑实质 (图2);至15 d组，Nestin阳性细胞较前有所减少;而20 d组则减少更为明显。

　　2.2.2 SEZ (表2)： 在正常组及假手术对照组，SEZ存在少量Nestin 阳性细胞。在脑缺血组，1 d组Nestin阳性细胞即有所增加;之后，随着时间的延长，围绕SEZ的Nestin阳性细胞明显增多，且排列不规则，有局部集聚的现象，外侧壁的Nestin阳性细胞由正常的1层增加到3～4层，胞体变大，突起增长，并有向外侧迁移进入脑实质的迹象 (图3);20 d组，SEZ 中的Nestin虽然仍多于对照组，但少于15 d组。

　　3 讨 论

　　3.1 缺血性脑损伤导致BrdU阳性细胞增多的意义 据文献报道，成年沙土鼠齿状回神经元在夹闭双侧颈总动脉10 min造成短暂全脑缺血后再生水平升高，且于缺血后11 d达到最高峰[3]。小鼠全脑缺血性脑损伤后也同样存在齿状回神经元增生现象，术后7 d可观察到小鼠齿状回BrdU标记阳性细胞明显增多，10 d时达到高峰，17 d时增生水平显著下降[4]。本研究结果显示：大鼠全脑缺血10 min再灌注24 h后BrdU阳性细胞即显著增多，7~10 d达到高峰，到15 d开始下降，20 d时仍高于对照组。BrdU是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在细胞增殖S期嵌入细胞核的DNA，因而BrdU阳性细胞被看作具有增殖活性的细胞，它是自体神经干细胞增殖的标记物[3]。这说明脑缺血在引起神经元损伤的同时，脑的内环境也出现了促使神经细胞增殖修复神经元损伤的因素;也就是说，缺血性脑损伤激活了脑内神经细胞的分裂、增殖及增殖细胞迁移。因此，缺血性脑损伤诱导的BrdU阳性细胞增多提示内源性NSC增殖。

　　3.2 缺血性脑损伤导致Nestin表达上调的意义

　　Nestin作为一种新发现的中间丝蛋白，是NSC的标志性抗原蛋白，因此，Nestin阳性细胞可被看作是NSC[5]。中间丝蛋白的表达和变化与细胞分化方向密切相关。有报道指出，在某些病理情况下，损伤可以使中枢神经系统相应部位出现Nestin的表达，如脑梗死后Nestin的表达可能与细胞增生有关[6，7]。本研究结果显示：缺血后SEZ和海马齿状回两个区域的Nestin阳性细胞均显著增多，且海马齿状回为缺血后严重受损区，支持上述推论。另外，资料显示[6-8]：缺血性脑损伤导致Nestin 的表达上调，有一个相对峰值区间。大鼠脑缺血再灌注模型中，在皮质和纹状体等处的缺血梗死区周围，7 d时出现强烈的Nestin标记记号，7 d后Nestin反应减弱。Krum等[9]通过脑损伤模型同样发现：损伤区周围Nestin反应阳性细胞于术后4~7 d最为明显，术后28 d消退。本研究发现：缺血性脑损伤导致Nestin表达上调的峰值位于缺血后7~10 d，与上述报道稍有不同。此外我们认为：Nestin表达与细胞增生有关，因为在正常的中枢神经系统发育过程中，NSC处于非常活跃的增殖状态，而胶质细胞增生与肥大又是脑缺血坏死后非常显著的特征之一，可能在中枢神经系统组织受损后，通过表达Nestin触发细胞的增生，从而达到由胶质细胞修复损伤的目的。另外，本研究结果还显示：在SEZ 和海马齿状回区同时观察到大量的BrdU阳性细胞和Nestin阳性细胞，两者的并行关系提示大量增殖细胞中的大部分为增殖的NSC。

　　3.3 脑缺血损伤后原位激活NSC的移行和分化

　　Iwai等[10]认为：脑缺血后的神经再生可分为增殖、迁移和分化三个阶段。沙土鼠脑缺血后10 d，海马齿状回细胞增殖达到最高峰;缺血20 d后，增殖细胞开始表达神经黏附分子，并从颗粒层下区迁移到颗粒层;但直到缺血后60 d，这些迁移的细胞才分化为成熟的神经元。本研究结果显示：缺血性脑损伤后NSC存在由SEZ和海马齿状回向外周脑实质迁移的趋势，但动态的NSC迁移过程以及NSC的分化规律尚不清楚，这是我们今后需要进一步系统研究的问题。

　　【参考文献】

　　[1] PULSINELLI W A, BUCHAN A M. The four-vessel occlusion rat model: method for complete occlusion of vertebral arteries and control of collateral circulation [J]. Stroke, 1988, 19(7): 913-914.

　　[2] 冯志博, 陈子琏, 李峰. 脑缺血大鼠大脑皮质NMDA受体的早期表达 [J]. 解剖学研究, 2003, 25(4): 290-292.

　　[3] CIARONI S, CECCHINI T, FERRI P, et al. Impairment of neural precursor proliferation increases survival of cell progeny in the adult rat dentate gyrus [J]. Mech Ageing Dev, 2002, 123(10): 1341-1352.

　　[4] JIN K, MINAMI M, LAN J Q, et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subvebtricular zone after focal cerebral ischemia in the rat [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(8): 4710-4715.

　　[5] MASLOV A Y, BARONE T A, PLUNKETT R J, et al. Neural stem cell detection, characterization, and age-related changes in the subventricular zone of mice [J]. J Neurosic, 2004, 24(7): 1726-1733.

　　[6] KOMITOVA M, ZHAO L R, GIDO G, et al. Postischemic exercise attenuates whereas enriched environment has certain enhancing effects on lesion-induced subventricular zone activation in the adult rat [J]. Eur J Neurosci, 2005, 21(9): 2397-2405.

　　[7] 雷万龙, 袁群芳, 董志宏, 等. 大鼠局灶脑缺血诱导巢蛋白的反应模式 [J]. 中国病理生理杂志, 2002, 18(6): 639-642.

　　[8] TONCHEV A B, YAMASHIMA T, SAWAMOTO K, et al. Enhanced proliferation of progenitor cells in the subventricular zone and limited neuronal production in the striatum and neocortex of adult macaque monkey after global cerebral ischemia [J]. J Neurosci Res, 2005, 81(6): 776-788.

　　[9] KRUM J M, ROSENSTEIN J M. Transient coexpression of nestin, GFAP and vascular endothelial growth factor in mature reactive astroglia following neural grafting or brain wounds [J]. Exp Neurol, 2003, 160(2): 348-360.

　　[10] IWAI M, SATO K, KAMADA H, et al. Temporal profile of stem cell division, migration, and differentiation from subventricular zone to olfactory bulb after transient forebrain ischemia in gerbils [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2003, 23(3): 331-341.