大鼠液压脑损伤后bcl-2和bax基因的表达分布

　　作者：高进喜， 王水良， 王如密， 王守森， 郑兆聪 作者单位：中国人民解放军南京军区福州总医院 1. ; 2. 实验科， 福建 福州 350025

　　【摘要】 目的 观察脑损伤后凋亡相关基因bcl-2、bax在脑组织中的表达特点。 方法 SD大鼠12只，随机分为假手术组 (n = 4) 和液压打击脑损伤组 (n = 8)。采用侧方液压打击制作颅脑损伤模型，应用免疫组化和原位杂交法及计算机显微图像分析技术，观察SD大鼠脑损伤后12 h脑内bcl-2、bax蛋白和mRNA阳性细胞的分布。 结果 侧方液压打击伤后，bcl-2、bax基因在损伤侧大脑皮质、海马表达明显增强，挫裂伤组织内血肿周边的bcl-2、bax基因表达亦明显增强，阳性细胞表达强度受打击能量和颅内血肿影响而呈梯度分布。 结论 大鼠侧方液压脑损伤后，bcl-2和bax基因表达受打击能量和颅内血肿的影响，由高到低逐渐递减。这一现象为认识脑损伤后迟发性神经元死亡提供了帮助。

　　【关键词】 颅脑损伤 bcl-2 bax 原位杂交 侧方液压打击模型

　　Expression of bcl-2 and bax gene in rats brain after unilateral fluid percussion brain injury

　　GAO Jinxi1, WANG Shuiliang2, WANG Rumi1, et al.

　　1. Department of Neurosurgery; 2. Department of Experiment, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Area Command,Fuzhou 350025, China

　　Abstract: Objective To observe the expression characteristic of apoptosis related gene (bcl-2 and bax) after unilateral fluid percussion brain injury. Methods Twelve Sprague-Dawley rats were divide into pseudo-operation group (n = 4) and brain injury group (n = 8) randomly. Traumatic brain injury was performed by unilateral fluid percussion brain injury. The expression of bcl-2 and bax gene was analyzed by immunohistochemical method and in situ hybridization through computer image analysis system. Results In the ipsilateral cerebral cortex and hippocampus, the expression of bcl-2 and bax protein and mRNA was increased 12 h after fluid percussion injury significantly. The expression of bcl-2 and bax gene was also increased near the hematoma. The gradient distribution of positive cells was effected by the percussion energy transmission and hematonma in the brain tissue. Conclusion The expression of bcl-2 and bax gene after unilateral fluid percussion brain injury descended from a higher to a lower level by the percussion energy and the hematoma respectively, this phenomenon maybe help us to recognize the delayed neuron death after brain injuries.

　　Key words： craniocerebral trauma; bcl-2; bax; in situ hybridization; unilateral fluid percussion injury 研究表明：bcl-2 (凋亡抑制因子) 和bax (凋亡促进因子) 基因表达与脑损伤后迟发性神经元死亡密切相关。本实验观察大鼠液压脑损伤后脑组织中bcl-2、bax蛋白和mRNA的表达分布特点，以阐述颅脑损伤后神经功能缺失的病理生理机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组和侧方液压打击脑损伤模型的建立 3月龄雌性健康SD大鼠12只 (上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供)，体质量250~300 g，随机分为2组：假手术组 (n = 4，只做手术准备，不打击致伤);液压打击脑损伤组 (n = 8)，常规建立侧方液压脑损伤模型[1]。

　　1.2 标本取材和石蜡切片的制备 动物于打击伤后12 h腹腔注射2%戊巴比妥过量麻醉，开胸经左心室插管至主动脉，依次灌注生理盐水200 ml，4%多聚甲醛250 ml，然后取脑组织浸入4%多聚甲醛36 h，再将组织块脱水透明包埋，最后将制好的蜡块用石蜡切片机自视交叉向后进行连续冠状切片，片厚8 μm。

　　1.3 免疫组化ABC法步骤[1] 切片脱蜡水化后进行ABC三步法染色，bcl-2 和bax抗体 (小鼠源性单克隆抗体，Santa Cruz公司提供) 滴度均为1∶400，ABC复合物滴度1∶100，DAB显色时间10~15 min。

　　1.4 原位杂交检测[2] 原位杂交步骤为杂交、抗体孵育和显色，bcl-2和bax mRNA探针由第二军医大学基础部神经生物教研室提供。

　　1.5 观察指标和统计学处理 用计算机显微图像分析系统观察bcl-2、bax阳性细胞分布，计算单位面积阳性细胞数。数据用x ± s表示，采用SPSS10.0统计软件行统计学分析，以P <0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 阳性细胞分布 Bcl-2和bax蛋白主要位于核膜上，在内质网、线粒体外膜上也有分布，因此阳性细胞主要在胞质着色，胞核也可见少量染色，呈弥漫性或散在棕黄色颗粒。免疫反应阳性神经元呈内部为空泡的三角形和多角形，高倍镜下可见树突和轴突 (图1)。阳性细胞主要分布于伤侧大脑半球皮质，以损伤侧大脑皮质打击部位为中心，向远处放射，呈现由高到低的梯度分布特点 (图2)，海马CA2、CA3、CA4及齿状回的神经元和神经胶质细胞也有表达;损伤对侧的大脑半球免疫组化染色为阴性，海马区为弱阳性，阳性细胞不可辨识。另外，本实验发现在脑挫裂伤组织内的血肿周边，bcl-2、bax免疫阳性细胞也明显增多，且亦由高到低呈梯度递减分布 (图3)。假手术组bcl-2和bax蛋白免疫组化染色均为阴性。bax免疫组化阳性细胞分布与bcl-2基本相似。

　　Bcl-2和bax mRNA原位杂交阳性信号呈紫蓝色，位于细胞质中。侧方液压打击伤后，bcl-2和bax mRNA表达显著增强，以损伤侧大脑皮质打击部位为中心，向远处放射 (图4)，分布特点与免疫组化结果相似，不同的是海马CA2、CA3、CA4及齿状回的神经元表达显著增强。在脑挫裂伤组织内的血肿周边，bcl-2、bax原位杂交阳性细胞增多，亦与免疫组化结果相似 (图5)。对侧大脑半球和假手术组bcl-2和bax mRNA原位杂交呈阴性 (不显色) 或弱阳性 (海马区可见淡紫蓝色，细胞不可辨识)。

　　2.2 阳性细胞计数 为了方便理解免疫反应阳性细胞以损伤侧大脑皮质打击部位为中心呈由高到低向远处递减分布的特点，我们将打击部位皮质由近及远分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个区 (图2，图4)，统计单位面积阳性细胞数 (表1)，结果Ⅲ区阳性细胞数显著性低于Ⅰ区 (P <0.01)。

　　3 讨 论

　　侧方液压打击脑损伤模型通过液压装置骤然改变密闭颅腔内的压力，从而造成颅脑损伤，其装置简单，稳定性和重复性好，伤情可分级。本实验打击强度为 (1.5 ± 0.2) atm，造成中度脑损伤，SD大鼠打击伤后早期神经行为学改变无明显差异，符合设计要求。且因液压打击单侧造成脑损伤，打击伤的对侧大脑半球可作为对照，可用于观察打击能量的传递作用对不同部位脑组织基因表达的影响。

　　大量实验证实，创伤性脑损伤后存在细胞凋亡[3]，凋亡抑制因子bcl-2和凋亡促进因子bax蛋白的表达与受损神经细胞的转归密切相关[4，5]，由于bcl-2、bax基因属于即刻早期基因 (immediate early gene，IEG)，在创伤后数小时即被激活，24 h达高峰，1周后恢复正常。因此，本实验选择bcl-2和bax作为研究对象，选取脑损伤早期较关键的12 h作为观察时间点。

　　免疫组化结果表明：侧方液压中度脑损伤后，在大鼠损伤侧皮质和海马，尤其是损伤区周围皮质和同侧海马CA3、CA4及齿状回等区域，bcl-2和bax蛋白免疫阳性细胞大量增加，这与有关神经损伤后bcl-2和bax蛋白表达变化的报道一致;且本实验发现：阳性细胞以损伤侧大脑皮质打击部位为中心向远处放射，并呈由高到低分布。bcl-2、bax在受到癫、缺血、创伤、中毒等因素刺激后，可被不同程度地激活，其激活程度受损伤性刺激强度的影响，在一定限度内，刺激强度越大，凋亡相关基因的表达也越强。我们推测：侧方液压脑损伤后，(1.5 ± 0.2) atm的打击能量由外到内不断衰减，是产生从损伤侧皮质打击部位为中心向远处放射，并呈由高到低分布这一现象的原因。

　　本实验还发现，脑挫裂伤组织的血肿周边bcl-2、bax免疫阳性细胞显著增多，且呈由高到低分布。可以肯定，颅内血肿的损伤性刺激导致bcl-2和bax基因激活。研究认为，颅内血肿的有害作用有两方面：其一，血肿占位效应可引起周围脑组织微循环障碍，脑细胞变性坏死[6，7];其二，血肿分解产物如含铁血红蛋白等生物活性物质可直接对神经元产生毒性作用[8]。我们认为，上述作用可能引起了血肿周边bcl-2、bax免疫阳性细胞增多，但阳性细胞增多呈由高到低分布的原因仍有待进一步研究。许多研究表明：微创清除颅内血肿能明显减轻脑出血的继发性损害，本研究也从分子生物学角度证明了血肿的危害，为清除脑挫裂伤内部的血肿提供了理论依据。

　　需要指出的是，一些研究认为：脑组织受应激性损伤后，海马CA3区免疫阳性细胞最多，其次才是皮质;而本实验发现损伤侧海马bcl-2和bax免疫阳性细胞较少，仅为损伤侧皮质阳性细胞计数的1/2~1/3。这与以往的研究[9]不一致，我们认为可能是由于海马神经元受应激后的应答反应速度较慢而皮质反应较快[10]，损伤后12 h bcl-2和bax蛋白在海马表达尚处于较低水平而在皮质已达较高水平，正是这种反应速度的不同造成了上述不一致。另外，由于即刻早期基因的表达与创伤性应激的程度有关，在本研究采用的打击模式和强度下，直接受力的顶叶皮质很可能受伤较重而海马损伤较轻，故此海马的bcl-2和bax基因表达弱于皮质。

　　由于蛋白表达水平的高低受到转录、翻译等许多因素的影响，因此，本实验利用原位杂交方法，从转录水平进一步探求bcl-2和bax基因的表达特点。侧方液压打击伤后，bcl-2和bax mRNA表达显著增强，且同样以损伤侧大脑皮质打击部位为中心向远处放射，分布特点与免疫组化结果相似;脑挫裂伤组织的血肿周边，bcl-2、bax原位杂交阳性细胞增多也与免疫组化结果相似。与免疫组化结果不同的是，海马CA2、CA3、CA4及齿状回的神经元bcl-2和bax mRNA表达增强更显著，我们认为可能是原位杂交方法更为敏感所致。

　　为了便于理解免疫反应阳性细胞以损伤侧大脑皮质打击部位为中心向远处呈由高到低分布的特点，我们将打击部位脑皮质由近及远分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个区，阳性细胞计数结果显示Ⅰ区和Ⅲ区细胞数差异有统计学意义。由于标本为冠状位连续切片，厚度仅为8 μm，因而同一标本相邻的两张切片可看作同一张切片，在相同部位bcl-2和bax的蛋白及mRNA表达具有一定可比性，同一部位的bcl-2/bax比例具有了现实意义：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区的bcl-2/bax比例呈逐渐升高趋势。根据凋亡相关理论：bcl-2/bax比例决定细胞受刺激后凋亡还是存活，bcl-2/bax比例越低，细胞越趋向于凋亡。由此我们推断：离液压打击损伤部位越近，神经细胞凋亡的可能性越大，脑损伤后迟发性神经元死亡的可能性也就越大[11]。

　　由于脑组织内的bcl-2、bax基因属于即时反应基因，并通过对晚期反应基因的调控，最终影响神经元的功能、生存或死亡。本研究通过对侧方液压脑损伤后大鼠脑组织中bcl-2和bax基因表达分布进行观察，验证了bcl-2和bax基因与迟发性神经元死亡之间的密切关系，并从分子生物学的角度证明了颅内血肿的危害，为清除脑挫裂伤内部血肿提供了理论依据。

　　【参考文献】

　　[1] 高进喜, 卢亦成, 江基尧, 等. 幼龄和老龄大鼠液压脑损伤后NGF、bcl-2、bax蛋白的表达 [J].第二军医大学学报, 2003, 24(5): 496-498.

　　[2] 高进喜, 卢亦成, 王如密, 等. 幼龄和老龄大鼠液压颅脑伤后NGF mRNA表达差异 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2004, 3(5): 424-427.

　　[3] NATHOO N, NAROTAM P K, AGRAWAL D K, et al. Influence of apoptosis on neurological outcome following traumatic cerebral contusion [J]. J Neurosurg, 2004, 101(6): 233-240.

　　[4] GAJEWSKI T F, THOMPSON C B. Apoptosis meets signal transduction: elimination of a BAD influence [J]. Cell, 1996, 87(4): 589-592.

　　[5] MICHAELIDIS T M, SENDTNER M, COOPER J D, et al. Inactivation of bcl-2 results in progressive degeneration of motoneurons, sympathetic and sensory neurons during early postnatal development [J]. Neuron, 1996, 17(1): 75-89.

　　[6] MACHENZIE J M, CLAYTON J A. Early cellular events in the penumbra of human spontaneous intracerebral hemorrhage [J]. J Stroke Cerebrovasc Dis, 1999, 8(1): 1-8.

　　[7] MATSUSHITA K, MENG W, WANG X, et al. Evidence for apoptosis after intercerebral hemorrhage in rat striatum [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2000, 20(2): 396-404.

　　[8] YONEZAWA T, HASHIMOTO H, SAKAKI T. Serial change of cerebral blood flow after collagenase induced intracerebral hemorrhage in rats [J]. No Shinkei Geka, 1999, 27(5): 419-425.

　　[9] 骆纯, 朱诚, 卢亦成, 等. 大鼠液压脑损伤后Bcl-2、Bcl-x和Bax蛋白表达的改变 [J]. 第二军医大学学报, 2001, 22(1):54-56.

　　[10] ZHU Y, PREHN J H, CULMSEE C, et al. The β2-adrenoceptor agonist clenbuterol modulates Bcl-2, Bcl-xl and Bax protein expression following transient forebrain ischemia [J]. Neuroscience, 1999, 90(4):1255-1263.

　　[11] HONG J, GUI J, ZHOU Y, et al. Study on cognition disorder and morphologic change of neurons in hippocampus area following traumatic brain injury in rats [J]. Chin J Traumatol, 2002, 5(1): 36-39.