大鼠急性局灶性脑损伤后血脑屏障通透性的变化

　　作者：岳淑敏 陈晓峰 鲁晓花 王长卿 王 珅 作者单位：河北北方学院附属第三医院神经内科,河北 张家口 075000

　　【摘要】 目的:颅脑损伤后血脑屏障(bloodbrain barrier,BBB)通透性的变化是导致外伤性脑水肿的最直接的因素。研究脑BBB 改变对探讨颅脑损伤脑水肿发生发展过程有重要意义。方法:84只wister大鼠随机分为对照组(n=12)和脑损伤组,脑损伤组采用Feeneys 自由落体撞击法建立急性局灶性脑挫裂伤模型，按伤后不同观察时相点又分为6个亚组,每亚组12只。每组取6只测量伤侧脑组织伊文思蓝(Evans Blue,EB)含量,另6只做脑组织含水量测定。 结果:研究发现伤后30min时已可见BBB开放，伤后24～72h组最明显，伤后168h BBB功能仍未恢复。结论:脑含水量的变化与脑组织中EB 含量变化不同步,BBB 的开放先于脑水肿的形成。提示脑损伤后脑水肿的治疗应从早期开始，并持续一周以上。

　　【关键词】 脑损伤;脑水肿;血脑屏障

　　The Changes of Permeability of the Blood Brain Barrier

　　after Acute Regional Contusion and Laceration in Rats

　　YUE Shumin,CHEN Xiaofeng,LU Xiaohua,et al

　　Dept.of Neurology,The Third Affiliated Hospital,Hebei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei,China

　　【ABSTRACT】 Objective:To study the changes of permeability of bloodbrain barrier(BBB)which directly cause brain edema after brain injury.It is very important to explain the development of brain edema.Methods:Eightyfour Wistar rats were randomly divided into control group(n=12)and brain injury group.The rats in brain injury group were divided into six subgroups according to different observation time points after brain injury,n=12.In each subgroup there were nine rats.Rat models with acute regional contusion and laceration of the brain were established by Feeneys impact with a free fall weight.The water content of the brain tissue was measured on six random rats of each group,The Evanse blue(EB)content was observed on the other six rats of each group.Results:It was found that BBB opened at 30 min and reached its peak between 24～72 hours,and the peak lasted till 168 hours after brain injury.Conclusion:The water content and EB content in brain tissue changed in different pace and the BBB was disrupted before the formation of brain edema.So the treatment of brain injury should begin earlier and last 168h at least.

　　【KEY WORDS】 Brain Injuries，Brain Edema，BloodBrain Barrier(BBB)

　　近年来研究表明,脑外伤后脑水肿的产生及发展与血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的损害直接相关,并由此引起脑组织的继发性损害[1]。我们通过Feeneys 自由落体撞击法建立急性局灶性脑挫裂伤动物模型,测量伤侧脑组织伊文思蓝(evans blue,EB)含量、脑组织含水量,并观察伤侧脑组织BBB 的改变,以探讨脑损伤后BBB 通透性的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组 成年健康Wister 大鼠84只,雄性,体重200～250g,随机分为对照和脑损伤组,脑损伤组按损伤后不同观察时相点又分为30min、3h、24h、48h、72h、168h 组。每组12只,每组取6只做脑组织含水量测定,另6只做EB测定。

　　1.2 实验方法 采用Feeneys[2]自由落体撞击法致脑挫裂伤造模。脑损伤组用1%戊巴比妥钠按30mg/kg体重腹腔注射麻醉。右顶开颅,以750g·cm致伤力致伤。脑损伤组大鼠致伤后,按预定时相点断头处死。对照组开颅同损伤组,但不致伤,24h后取材,观察项目同损伤组。

　　1.3 脑组织含水量的测定 每组6只以损伤灶为中心冠状切开脑标本,额侧一半投入10%缓冲甲醛中固定行HE 组织化学染色。枕侧一半取损伤灶后缘脑组织一块,重约100±10mg,以滤纸吸去表面血迹和CSF,用电子分析天平测湿脑组织重量,110 ℃恒温箱烘烤24h 至恒重,置于干燥缸冷却10min取出称干重，用干湿重法计算脑组织含水量。计算公式为:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/ 湿重×100%。对照组假手术后24h 做同样处理。

　　1.4 伊文思蓝(EB)测定 每组6 只处死前1h通过尾静脉注射2%EB(2mg/kg),经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,快速开胸暴露心脏,迅速穿刺左心室后剪右心房一小口,用37℃生理盐水500mL灌注,至右心耳流出清亮液体,以清除血液中染料。用甲酰胺消化法测脑组织EB含量:取脑损伤侧脑半球组织标本测湿重后放入盛有4倍其体积的甲酰胺的离心管中,盖上盖子45℃水浴24h,1500r/min 离心10min,取上清液,用7230G分光光度仪在EB最大吸收光谱635nm处测吸光度,在伊文绘制的标准曲线上查得EB含量。结果以μg/ mL脑组织表示。对照组假手术后24h做同样处理。

　　1.5 统计学处理 计量资料以均数±标准差表示(x±s)。采用SPSS10.0软件进行t检验。P<0.05 为有统计学差异。

　　2 结果

　　2.1 伤区脑组织含水量变化 脑损伤后30min伤区脑组织含水量已明显升高(P<0.05)，伤后24～ 72h脑组织含水量达高峰(P<0.01)，伤后168h时脑组织含水量有所下降，但仍高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1) 。

　　2.2 伤区脑组织EB含量变化 颅脑损伤后30min伤区脑组织即明显有EB渗透(P<0.01),含量于伤后24h达高峰(P<0.01)，168h基本恢复正常，与对照比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表1 )。表1 损伤区脑组织含水量和脑组织EB含量的变化 注：与对照组比较:*P< 0.05;**P<0.01

　　2.3 大体形态观察 损伤组模型大脑标本取出后可见右顶明显的局灶性脑挫裂伤灶,伤灶内可见出血点。伤灶大小约为5.5mm ×5.5mm。伤灶周围可见蛛网膜下腔出血(SAH),远离伤灶区域及左侧大脑半球未见明显SAH。

　　3 讨论

　　血脑屏障是由脑微血管内皮细胞、星形神经胶质细胞、外膜细胞、血管周围巨噬细胞和基底膜组成的一个复杂系统，对维持正常的中枢神经系统功能非常重要[3]。脑损伤过程中伴随血脑屏障通透性的变化，颅脑创伤导致BBB 结构与功能受损从而引起脑水肿、脑缺血缺氧等一系列病理生理改变已得到证实和肯定[4，5]。

　　外伤性脑水肿是混合性脑水肿，脑损伤后BBB的开放与脑水肿的形成存在不同步现象。Baskaya等[6](1997)观察到,脑冲击伤后脑含水量逐渐增加,24h达高峰,但比BBB的开放迟缓,3d后脑含水量逐渐降低,但此时BBB通透性再次增加,说明创伤后BBB存在双期破坏。Baldwin等[7](1996)用辣根过氧化物酶(HRP)作示踪物观察BBB通透性时也有基本相同的发现,伤后5min受伤部位出现浓染,伤后3h HRP外渗量降低,这种情况在伤后6h和12h仍然存在,伤后第1d和第2d HRP浓染再次出现,伤后3～5d BBB的功能重新建立。Fukuda 等[8](1995)在大鼠脑液压冲击模型上观察了不同脑区BBB通透性的改变,结果发现伤区的皮质部位脑血管对HRP的通透性于损伤后3～60min均处于较高水平,丘脑、海马和中脑等部位在伤后3min BBB通透性增加明显,而后逐渐恢复,矢状缝周围的皮质组织在伤后3min BBB通透性无明显改变,但随后通透性逐渐增加,也存在BBB的再次开放。Chen等[9](1996)发现闭合性脑外伤早期(24h内)，在BBB血浆蛋白通透性增加的同时，脑含水量也显著增加，而且BBB通透性的变化要先于脑水肿的形成，但并未观察到BBB再次开放;在脑裂伤和冷冻伤后亦观察到的BBB开放期和脑水肿形成不一致现象。本实验结果显示,脑损伤组伤后30min脑组织含水量比对照组明显增加,24～72h最为明显(P<0.01)，伤后168h脑组织含水量虽出现一定程度下降，但与对照组相比仍存在显著差异(P<0.05)。伤后30min脑组织即有EB渗透,含量于伤后24h达高峰(P<0.01)，168h已基本恢复正常(P>0.05)，伤后30min、3h、48h及72h组虽与对照组也存在差异,但低于伤后24h组,说明BBB的开放先于脑水肿的形成,未发现BBB有明显的二次开放。与上述部分学者研究结果不同,可能与脑损伤较局限有关。

　　本实验结果表明：脑损伤后30min BBB已经开放，并逐渐加重，脑组织的水肿迟于BBB改变，并持续7d。说明脑损伤时BBB通透性增高的原因不仅仅是单纯机械损伤因素引起，还可能与局部组织缺血缺氧造成生化血管活性物质改变及自由基的产生等因素有关。 因此，本研究提示：脑损伤后脑水肿的治疗应从早期开始，并持续一周以上。

　　【参考文献】

　　1 江基尧，朱诚，罗其中.现代颅脑损伤学[M].第2版. 上海：第二军医大学出版社，2004.624641

　　2 Feeney DM,Boyeson MH,Linn RT,et al.Response to cortical injuy:1.Met hodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211,6777

　　3 王忠诚，王忠诚.神经外科学[M].武汉：湖北科学技术出版社，2005.366379

　　4 于如同，官鹏，毛庆，等.脑外伤后脑微血管扫描电镜观察及临床意义[J].中国微循环，2003，7(1)：3133

　　5 杨治权,马建荣,曹庆善,等.弥漫性脑损伤脑微血管形态学研究[J].中华神经外科杂志,2001,17(6):382384

　　6 Baskaya MK,Rao AM,Dogan A,et al.The biphasic opening of the blood brain barrier in the cortex and hippocampus after traumatic brain injury in rats[J].Neurosci Lett,1997,226,3336

　　7 Baldwin SA,Fugaccia I,Brown DR,et al.Blood brain barrier breach following cortical contusion in the rats[J].J Neurosurg,1996,85(3):476481

　　8 Fukuda K,Tanno H,Dogan A,et al.The blood brain barrier disruption to circulating protein in the early after fluid percussion brain injury in rats[J].J Neurot rauma,1995,12:315324

　　9 Chen Y,Comstantini S,Trembovler V,et al.An experimental modal of closed injury in mice:pathophysionlogy,histopathology and cognitive deficits[J].J Neurotrauma,1996,13(10):557568