老年缺血性脑卒中患者eNOS基因VNTR多态性研究

　　作者：韩红星 高洪云 作者单位：临沂市人民医院神经内科，山东 临沂 276000

　　【摘要】 目的 探讨老年缺血性脑卒中与内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)基因变数串联重复序列(VNTR)多态性的关系。方法 选择老年缺血性脑卒中患者112例作为病例组，同期选择年龄与性别相匹配的健康志愿者或其他住院患者105例作为对照，通过PCR技术和聚丙烯酰胺电泳来确定其基因型。结果 病例组eNOS基因ab基因型的频率明显高于对照组(22.3% vs 12.4%，P<0.05)，a等位基因的频率也高于对照组(12.9% vs 7.0% ，P<0.05)。结论 ab基因型与老年缺血性脑卒中有相关性，a等位基因可能是中国老年缺血性脑卒中的独立危险因素。

　　【关键词】 一氧化氮合酶;基因多态性;VNTR;老年;缺血性脑卒中

　　血管内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)编码基因存在多种基因多态性。其中，第4号内含子27个碱基的变数串联重复序列(VNTR)多态性与血浆一氧化氮(NO)水平密切相关，该多态性与心脑血管病的相关性研究较多，但结论并不一致。Matyar等〔1〕研究发现内皮细胞型NOS(eNOS)4a/b基因多态性是南部土耳其人冠心病的独立危险因素，而Vasilakou等〔2〕发现在希腊人中该基因多态性与早发的冠心病没有相关性。本研究的目的是探讨eNOS基因VNTR多态性与中国老年缺血性脑卒中的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 入选标准

　　选择2002年7～12月在青岛大学医学院附属医院住院的112例老年缺血性脑卒中患者作为病例组,其中36例短暂性脑缺血发作(TIA)，76例脑梗死，均行头颅MRI和/或CT扫描明确诊断，符合1996年第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准，并排除脑出血和占位性病变。选取同期住院的其他疾病患者和健康志愿者105例作为对照。对照组均无脑卒中或冠心病病史。病例组平均年龄(64.9±11.2)岁，男62例;对照组平均年龄(63.9±11.9)岁，男53例，两组的年龄与性别相匹配,入选对象均行血糖、血脂等检查。

　　1.1.2 诊断标准

　　高血压的诊断标准为血压≥140/90 mmHg或正服用降压药物;糖尿病的标准为空腹血糖≥7.0 mmol/L或服用降血糖药物;吸烟的标准为正在吸烟>5支/d或有吸烟史，血脂异常的标准为总胆固醇(TC)≥5.62 mmol/L和/(或)甘油三酯(TG)≥1.92 mmol/L或服用降血脂药物。

　　1.2 方法

　　1.2.1 提取基因组DNA

　　入选者均于清晨空腹抽取静脉血1 ml,加20 μl EDTA(浓度150 ng/ml)抗凝，4℃冰箱短期存放。采用UltraPureTM基因组DNA提纯试剂盒(北京赛百盛公司生产)，提取的基因组DNA置于-20℃保存。

　　1.2.2 目的基因片段PCR扩增方法

　　引物参照Uwabo等〔3〕的设计。正义寡核苷酸序列为5′GGGAACCTCAGCCCAGTAGTGAA3′，反义寡核苷酸序列为5′GTGGTCACAGGCGTTCCAGTAAC3′。反应总体系50 μl，其中10×Buffer 5 μl，dNTPs 1 μl，引物各5 μl，模板DNA 2 μl(约150 ng)，Taq酶1.5 U(0.3 μl)，甲酰胺1μl，用双蒸水补齐至50 μl。反应条件：预变性94℃ 3 min后进入循环，每个循环为：变性94℃ 45 s，退火56.5℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，35个循环后72℃延伸12 min终止反应。取3 μl PCR扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上做垂直电泳，电压60 V，时间3 h，以pGEM7Zf(+)HaeⅢ Marker(华美公司生产)为参照,在0.5 μg/ml溴化乙锭染液中染色40 min后在紫外线灯下观察结果并照相。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS统计软件，计量资料组间比较用非配对的t检验，计数资料组间比较用χ2检验，应用Logistic回归分析计算比数比并进行危险因素独立性分析。

　　2 结 果

　　2.1 病例组与对照组各种危险因素比较

　　吸烟、高血压、糖尿病等在病例组的比例均较对照组高(P<0.05)。血脂异常发生率在病例组也较高，但无显著性差异(P>0.05)，见表1。表1 两组各危险因素的比较〔n(略)〕

　　2.2 eNOS基因VNTR多态性电泳结果

　　eNOS基因VNTR多态性主要有2种等位基因，27 bp的序列重复4次为a，重复5次为b，在电泳图中分别为417 bp和444 bp的片段，从而构成3种基因型(aa，ab，bb)，见图1。

　　2.3 两组eNOS基因型和等位基因频率的比较

　　病例组与对照组的ab基因型频率分别为22.3%和12.4%，两者比较有显著差异(P<0.05)。a等位基因频率在病例组为12.9%，较对照组(7.0%)明显偏高(P<0.05)，见表2。表2 卒中组与对照组的基因型及等位基因频率比较〔n(略)〕

　　2.4 病例组各种危险因素的独立性分析

　　病例组各危险因素及eNOS VNTR多态性的比数比(OR)分析及95%可信区间(95% CI)，见表3。通过对各种危险因素的多元Logistic回归分析发现，高血压、糖尿病、吸烟及ab基因型与老年缺血性脑卒中均明显相关，是老年缺血性脑卒中的独立危险因素。表3 病例组各危险因素以及ab基因型的OR值及95%CI(略)

　　3 讨论

　　NOS是NO合成的关键酶，可催化精氨酸代谢为NO和瓜氨酸。根据细胞和组织来源分为3种：神经元型(nNOS)、内皮细胞型(eNOS)和免疫型NOS(iNOS)。eNOS主要存在于血管内皮细胞中，可以被多种介质激活，包括乙酰胆碱、P物质、组氨、精氨酸、血管加压素、缓激肽、前列腺素F和内皮素R等。eNOS的激活导致内皮细胞中NO的产生增加，并引起一系列的生物学效应，如舒张平滑肌细胞，抑制血小板聚集和黏附于血管内皮，抑制血管平滑肌细胞的增生，阻碍低密度脂蛋白的过氧化而发挥抗动脉粥样硬化作用等。NO还可通过抑制内皮素和血管紧张素的产生从而抑制血管平滑肌细胞的增生。

　　人类eNOS的编码基因位于第7号染色体长臂(7q36)，含有26个外显子和25个内含子，总长21 kb，编码产物为含有1 203个氨基酸的蛋白质。该基因存在多个多态性位点，其中研究最多的是4号内含子的VNTR多态性、7号外显子G849T多态性和启动子区T786C多态性。VNTR多态性主要有2种等位基因，27 bp的序列重复4次为a，重复5次为b，从而构成3种基因型(aa，ab，bb)。eNOS基因多态性可影响eNOS的功能，导致血管系统中NO浓度改变，并由此影响动脉粥样硬化的发生和发展，因此可能与冠心病和缺血性脑血管疾病有关。

　　eNOS基因不同位置的变异与心脑血管疾病的相关性不同。1996年Wang等〔4〕发现，澳大利亚长期吸烟者的eNOS第4号内含子基因多态性与冠心病关系密切，吸烟和eNOS4a/a分别在环境和遗传方面是导致冠心病的主要因素。Lee等〔5〕对韩国男性冠状动脉疾病病人暷研究也发现eNOS基因a/b多态性与小于51岁的男性患者的冠状动脉疾病的发展有相关性。Salim等〔6〕发现冠心病患者的等位基因a的频率明显高于对照组。Hou等〔7〕对中国人的研究，证实了eNOS第4号内含子基因多态性可能是中国人缺血性脑血管疾病的独立危险因素，在无常见危险因素的缺血性脑血管病患者中尤为显著。

　　eNOS基因多态性与冠心病、心肌梗死的关系得到了多国学者的肯定，但也存在分歧。德国学者Sigusch等〔8〕栐1 043例欧洲人的研究表明，冠心病及其严重程度与eNOS4a/b多态性无相关性。Yahashi等〔9〕对日本人该基因多态性与缺血性卒中的关系进行了研究，127例患者(其中18例为血栓栓塞，58例为腔隙性脑梗死，51例为无症状性腔隙性脑梗死)与91例对照的b等位基因频率之比为0.862/0.868，缺血性卒中亚组中等位基因的频率之比为0.889/0.862/0.853，其差别均无统计学意义。MacLeod等〔10〕在361例缺血性卒中患者与236例对照中，对eNOS基因7号外显子的G894T多态性进行了相关研究，发现NN基因型在两组中的分布无差异，提示该多态性与动脉粥样硬化性脑梗死和TIA无关。

　　本研究发现老年缺血性脑卒中组ab基因型的频率较对照组明显增高(22.3% vs 12.4%)，a等位基因的频率在病例组也明显偏高(12.9% vs 7.0%)。用多元Logistic回归分析校正了年龄、高血压、糖尿病和吸烟等危险因素的影响后，ab基因型较bb基因型的OR为1.98(95% CI=0.87～3.56，P< 0.05)，与Hou等〔7〕报道的结果一致,更进一步证实了在中国人群中eNOS基因VNTR多态性与缺血性脑卒中有相关性，ab基因型可能是影响中国老年人发生缺血性脑卒中的独立危险因素。

　　【参考文献】

　　1 Matyar S，Attila G，Acarturk E，et al.eNOS gene intron 4 a/b VNTR polymorphism is a risk factor for coronary artery disease in Southern Turkey〔J〕.Clin Chim Acta，2005;354(12):1538.

　　2 Vasilakou M，Votteas V，Kasparian C，et al.Lack of association between endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and risk of premature coronary artery disease in the Greek population〔J〕.Acta Cardiol，2008;63(5):60914.

　　3 Uwabo J，Soma M，Nakayama T，et al.Association of a variable number of tamden repeats in the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with essential hypertension in Japanese〔J〕. Am J Hypertension，1998;11(1 Pt 1):1258.

　　4 Wang XL,Sim AS,Badebhop RF,et al.A smokingdependent risk of coronary artery disease associated with a polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene〔J〕.Nat Med,1996;2(1):415.

　　5 Lee WH，Hwang TH，Oh GT,et al.Genetic factors associated with endothelial dysfunction affect the early onset of coronary artery disease in Korean malles〔J〕.Vasc Med,2001;6(2):1038.

　　6 Salim S，Firoozrai M，Nourmohammadi I，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene intron4 VNTR polymorphism in patients with coronary artery disease in Iran〔J〕.Indian J Med Res，2006;124(6)：6838.

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　　8 Sigusch HH，Surber R，Lehmann MH，et al.Lack of association between 27bp repeat polymorphism in intron 4 of the endothelial nitric oxide synthase gene and the risk of coronary artery disease〔J〕.Scand J Clin Lab Invest,2000;60(3):22935.

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　　10 MacLeod MJ，Dahiyat MT，Cumming A,et al.No association between Glu/Asp polymorphism of NOS3 gene and ischemic stroke〔J〕. Neurology，1999;53(2):41820.