金纳多对抗大鼠脑出血后脑水肿的作用机制

　　作者：杨霄鹏，李秋芳，杨瑞玲 作者单位：(郑州大学第二附属医院神经内科，河南郑州 450014;郑州大学护理学院临床教研室，河南郑州 450052;河南大学附属东京医院药剂科，河南开封 475001)

　　【摘要】 目的 探讨金纳多对抗脑出血后脑水肿形成的作用机制。方法 选健康Wistar大鼠80只，雌雄不拘，随机分为4组，每组20只。采用立体定向注射方法，用微量注射器在右侧尾状核部位，注入50μL生理盐水(A、B组)或等量自体血红蛋白(C、D组)。术后A、C组给予50g/L羧甲基纤维素钠溶液3mL灌胃，B、D组给予等量羧甲基纤维素钠溶解均匀的金纳多(200mg/kg)溶液灌胃，每日1次，持续3周。断头取脑，测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)值及血红素氧合酶1(HO1)阳性细胞数。结果 除A、B组比较无明显差异外，其余各组间SOD、MDA含量及HO1阳性细胞数比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 金纳多可以抑制血红蛋白所引起的脑水肿。

　　【关键词】 金纳多;脑出血;脑水肿;超氧化物歧化酶;丙二醛;血红素氧合酶1

　　Rivalry mechanism of ginkgo in rat brain edema　after intracerebral hemorrhage

　　Yang Xiaopeng, Li Qiufang, Yang Ruiling

　　(Department of Neurology, the Second Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou 450014; Clinical Department, Nursing College of　Zhengzhou University, Zhengzhou 450052; Department of Medicine,the Affiliated Dongjing Hospital of Henan University, Kaifeng 475001, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the rivalry mechanism of ginkgo in rat brain edema after intracerebral hemorrhage. Methods Totally 80 healthy Wistar rats were divided into 4 groups randomly (20 rats in each group). Fifty microliters saline (group A and group B) or autohemoglobin (group C and group D) was infused into the right caudate nuclears using stereo tactic guidance. Groups A and C were lavaged 50g/L carboxymethyl cellulose sodium solution of 3mL, groups B and D were lavaged the same amount of ginkgo (200mg/kg) solution dissolved by 50g/L carboxymethyl cellulose sodium solution once a day for 3 weeks. All the rats were decapitated after raised for 3 weeks, and superoxide dismutase, malondialdehyde, and the number of hemeoxygenase1 (HO1) positive cells in brains were assayed. Results The differences in SOD and MDA contents as well as HO1 positive cell number between every two groups were significant (P<0.05) except group A and group B. Conclusion Ginkgo can inhibit brain edema after intracerebral hemorrhage caused by hemoglobin.

　　KEY WORDS: ginkgo; cerebral hemorrhage; brain edema; superoxide dismutase; malondialdehyde ; hemeoxygenase1

　　红细胞自身溶解后释放的血红蛋白主要通过血红素氧合酶1(hemeoxygenase1, HO1)进行降解，其降解产物可通过多种途径引起脑水肿。金纳多是一种标准化银杏叶萃取物，能改善缺血脑组织的能量代谢，保护细胞膜的结构和功能的完整性，对缺血神经细胞有保护作用[12]。本研究以脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)值及免疫组化HO1为指标，观察金纳多对大鼠脑出血后脑水肿的保护作用，旨在为其广泛应用于临床防治脑出血后脑水肿提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 河南省实验动物中心提供的健康成年Wistar大鼠80只，雌雄不拘，体重260-300g。动物随机分为4组，每组20只。A组：注射生理盐水+溶剂;B组：注射生理盐水+金纳多+溶剂;C组：注射血红蛋白+溶剂;D组：注射血红蛋白+金纳多+溶剂。

　　1.2 仪器及主要试剂 SNⅢ型立体定向仪(日本KCS公司);Hamilton微量注射器(天津琛航科技仪器有限公司);UV8500PC紫外分光光度仪(天美科技有限公司);SABC免疫组化试验盒及DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物有限公司;SOD、MDA试剂盒购自南京生物工程研究所。

　　1.3 大鼠尾状核出血模型及对照模型的建立 100g/L水合氯醛(2mL/kg)腹腔麻醉后头、股部备皮，络合碘消毒切开右股部皮肤，切口长10mm，剥离暴露股动脉。由股动脉抽取自体血2mL并加肝素抗凝(50u/mL)。3000r/min离心10min，弃去上层血浆及白细胞和血小板，用预冷生理盐水冲洗红细胞3次，移至EP管中离心后置-196℃液氮罐中5min，用37℃水浴至完全解冻，制成自体血红蛋白。将大鼠固定在立体定向仪上，头部正中切开皮肤，长约15mm，30g/L双氧水剥蚀骨膜暴露前后囟门，调节定向仪使前后囟在同一水平面上。于前囟前0.5mm、中线右侧旁开3mm处牙钻钻一直径约1mm的小孔，不伤及硬脑膜。微量注射器抽取50μL自体血红蛋白并固定于立体定向仪上，自钻孔处垂直进针5.5mm，以3-5μL/min速度向C、D组大鼠尾状核内推注并留置20min，以免血液自针道返流。A、B组则以50μL生理盐水注入。骨蜡封闭钻孔,缝合切口。将金纳多(200mg/kg)研磨成粉，用50g/L羧甲基纤维素钠溶解并混匀，术后48h予B、D组灌胃(10mL/kg)，A、C组用等量50g/L羧甲基纤维素钠溶液灌胃。各组均每日1次，持续3周。

　　1.4 标本收集与检测 生化指标检测：3周后脱臼法处死大鼠，断头取脑，滤纸擦干脑表面的液体，分析天平称重，按1∶9加入生理盐水匀浆，4000r/min离心10min，取上清液，制成10%脑组织匀浆。用硫代巴比妥酸显色法测定MDA含量，再将10%脑组织匀浆稀释至1%，采用黄嘌呤氧化法检测SOD活力。按试剂盒操作程序进行测定。免疫组化检测：大鼠于出血3周后，100g/L水合氯醛腹腔麻醉，开胸暴露心脏，于心尖部剪一2mm左右小口，将穿刺针自此切口插入心脏并送达主动脉口处固定，37℃生理盐水200mL灌洗，继之以40g/L多聚甲醛溶液灌注内固定后断头取脑，置40g/L多聚甲醛溶液中后固定约8h，取尾状核部血肿周围脑组织，常规石蜡包埋，切片，进行免疫组化染色观察。HO1免疫组化阳性细胞显色为胶质细胞胞浆棕黄色。计数方法：每张切片取5个高倍镜视野，计数5个高倍视野内的阳性细胞总数，计算每高倍视野下阳性细胞均数。

　　1.5 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行数据处理。实验数据用±s表示，对结果进行方差齐性检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，多个样本均数间的两两比较用LSD法。取α=0.05为显著性检验水准。

　　2 结果

　　2.1 生化指标 脑组织SOD活性变化：A、B组明显高于C、D组(P<0.01);A、B组间无明显差异(P>0.05);D组较C组明显升高(P<0.01)。脑组织MDA含量变化：A、B组明显低于C、D组(P<0.01); A、B组间无明显差异(P>0.05);D组较C组明显降低(P<0.01，表1)。

　　表1 各实验组脑组织SOD活性、MDA含量的变化(略)

　　Table 1 SOD and MDA contents in the 4 groups

　　Group A: NS+solvent; Group B: NS+ ginkgo +solvent; Group C: hemoglobin +solvent; Group D: hemoglobin + ginkgo +solvent; *P <0.01 vs. groups C, D; △P<0.01 vs. group D

　　2.2 HO1染色阳性细胞数的变化 每高倍镜下HO1阳性细胞数：A组(30.90±3.67)、B组(30.50±4.19)显著低于C组(51.30±7.94)﹑D组(38.10±4.89)(P<0.01);A、B两组差异无统计学意义(P>0.05);C组显著高于D组(P<0.01)。表达特点：各组均见HO1阳性表达，可见星形胶质细胞胞浆呈棕黄色且较深，胞体肥大，突起增粗，数量增多(图1)。

　　图1 各组HO1的阳性表达情况(略)

　　Fig.1 The expression of HO1 in Groups A, B, C and D ×400

　　A: group A; B: group B; C: group C; D: group D

　　3 讨论

　　血红蛋白的过氧化作用是脑水肿产生的重要原因[3]。脑出血时，破碎红细胞释放大量血红蛋白，血红蛋白在HO作用下生成CO、Fe和胆绿素。这些代谢产物是过氧化剂和自由基的重要来源，通过细胞的氧化和过氧化应激，打破氧化和过氧化之间的平衡，对细胞产生特定的氧化毒性，造成脑水肿的发生。作为受自由基损害而产生的过氧化产物——MDA，其含量的多少能有效反映细胞损伤和机体受自由基攻击程度。SOD是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是O-2最有效的清除剂，它通过催化歧化反应来清除O-2，抑制脂质过氧化。本实验测得A、B组SOD无显著性差异(P>0.05)，说明金纳多并不能明显增强正常鼠的SOD活性;C组明显低于其他组，D组显著高于C组(P<0.01)而低于A、B组(P<0.01)，提示脑出血后大鼠SOD活力下降，金纳多能明显增强脑出血后大鼠SOD活力。A、B组MDA无显著性差异(P>0.05)，说明金纳多对正常鼠自由基损害影响不大，C组明显高于其他3组(P<0.01)，表明出血后自由基生成增多，清除能力下降，组织脂质过氧化损害;D组低于C组(P<0.01)而高于A、B组(P<0.01)，说明金纳多在大鼠脑出血后具有抗自由基、抗脂质过氧化作用。HO1是催化血红素转变为CO、Fe和胆绿素的限速酶，对氧化应激十分敏感。有学者观察到，HO1最明显的诱导部位恰恰就发生在出血部位及其相邻部位[4]，因此脑内胶质细胞中HO1的诱导表达可作为脑损伤的一个标志。HO1表达显著的区域脑损伤程度越严重。脑出血后HO1上调表达的机制，可能与以下因素有关：出血后红细胞释放的血红蛋白直接诱导了HO1基因[5];血脑屏障损害后，多种血浆成份漏入脑实质，可诱导HO1的表达[67];HO1基因上有血红素结合位点，血红蛋白的降解产物血红素作为底物，直接诱导HO1基因表达[8];血红素诱导的过氧化反应使体内自由基增高，氧自由基通过激活HO1基因启动区的细胞因子(NFκB)和活性蛋白(AP1)调节HO1 mRNA转录和蛋白合成的增加[9]。在本实验中，A、B组几乎未见HO1阳性表达，D组HO1阳性细胞有轻微表达，可见一些散在的胞浆呈棕黄色着色且颜色较深，胞体肥大的细胞，但数目明显比C组少;D组与C组之间差异具有显著性(P<0.05)。说明D组的大鼠脑过氧化损伤程度比C组小，可以认为金纳多针对血红蛋白所诱导的脑水肿有减轻和抑制作用。金纳多为第四代银杏叶提取制剂，含有24%的银杏黄酮甙和6%的萜类。黄酮类化合物的结构中含有还原性羟基功能团，是一类较强的抗氧化剂，不但可直接发挥抗氧化作用，清除O-2，还可调节SOD、过氧化氢酶等抗氧化酶的活性[10]。萜类没有直接清除氢氧基团的作用，但能提高黄酮清除氢氧基团的能力，这与萜类的支架样结构有关。另外，金纳多通过其具有的扩张脑血管、改善微循环、减少毛细血管通透性等作用促进血肿吸收，或通过某些尚不明确的机制直接抑制HO1的上调表达，从而减少血红蛋白降解，切断了过氧化剂和自由基的重要的来源，保护了神经细胞，减轻了脑水肿。

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