高免疫原性胶质瘤细胞疫苗体外抗瘤时靶细胞超微结构变化

　　作者：郑树法, 康德智, 林元相, 连葆强 作者单位：福建医科大学 附属第一医院神经外科，福州 350005

　　【摘要】 目的 观察高免疫原性人多形性胶质母细胞瘤(GBM)U251细胞疫苗体外诱发产生效应细胞杀伤靶细胞的超微结构变化。 方法 以500 U/mL干扰素γ(IFNγ)诱导48 h+热43℃休克2 h诱导膜型热休克蛋白70(HSP70)及主要组织相容性抗原复合体I类分子(MHCI)双高表达，经丝裂霉素(MMC)灭活制成高免疫原性细胞疫苗。体外刺激健康捐献者外周血单个核细胞(PBMCs)作为效应细胞(MHCHSPCTL)，进行肿瘤特异性杀伤试验;MTT比色法检测其杀伤活性;透射电镜观察靶细胞受攻击后情况。 结果 MHCHSPCTL对野生型U251细胞特异性的杀瘤活性明显高于HSP70分子单高表达的细胞疫苗刺激组(HSPCTL)、MHCI类分子单高表达的细胞疫苗刺激组(MHCCTL)以及野生型对照组(WCTL)(P<0.05)，透射电镜显示靶细胞受到攻击后出现不同程度凋亡样坏死和胀亡样坏死，胀亡样坏死细胞在高免疫原性细胞疫苗刺激的效应细胞组较多。 结论 介导细胞胀亡是高免疫原性即膜型HSP70和MHCI类分子双高表达疫苗的U251细胞疫苗一种重要主动特异性抗瘤机制。

　　【关键词】 基因, MHCⅠ类; 干扰素Ⅱ型; 热休克蛋白质70; 神经胶质瘤; 细胞系, 肿瘤; 癌症疫苗; 免疫疗法; 显微镜检查, 电子

　　热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)与主要组织相容性抗原复合体I类分子(major histocompatibility complex class I，MHCI)是参与抗原呈递两种重要的分子。近年来研究发现HSP参与机体特异的抗瘤免疫反应[1]，HSP表达量的多少与肿瘤免疫原性的强弱密切相关[2];MHCI表达的增加，与MHC结合并提呈在肿瘤细胞胞上的胶质瘤特异性抗原或胶质瘤相关性抗原量亦随之增加，胶质瘤的免疫原性可随其MHC表达量的增加而增加[3]。笔者先前研究证实了HSP70和MHCI类分子双高表达人多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)U251细胞疫苗具有高免疫原性[4]。本研究观察该类高免疫原胶质瘤细胞疫苗诱发产生效应细胞杀伤靶细胞时的超微结构变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1 材料 人多形胶质母细胞瘤细胞U251细胞(中科院上海生命科学研究所);SGC7901胃癌细胞株(福建医科大学药理研究室);RPMI1640(美国Gibcorl公司);小牛血清(美国Hyclone公司);含5%EDTA Typsin(美国Gibcorl公司); 3(4，5二甲基2噻唑)2，5二苯基溴化四唑(MTT，上海生物工程公司);丝裂霉素(日本Kyowa Hakko Kogyo 有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 GBM U251细胞的热免疫诱导分组及效应细胞的制备 取对数生长期、生长状态良好的U251细胞，分为500 U/mL干扰素γ(interferongamma，IFNγ)诱导48 h组;热43 ℃休克2 h组;先500 U/mL IFNγ诱导48 h+后热43 ℃休克2 h共3个诱导组。单因素热43 ℃休克2 h诱导组和双因素先500 U/mL IFNγ诱导48 h+后热43 ℃休克2 h后，立即放回37 ℃孵箱恢复2 h收集细胞。分别取上述3组细胞及未经任何刺激的处于对数生长期野生型U251细胞单细胞悬液(野生型对照组)，于0.2 mg/mL的丝裂霉素(MMC)灭活2 h。0.4%胎盼蓝染色检测灭活后U251细胞存活率;取健康捐献者外周血50 mL以淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)，计数，调整细胞浓度为5×106 mL-1备用;将PBMCs与3种人脑胶质瘤细胞疫苗按5∶1的比例共孵以诱导产生3种不同效应细胞，即MHCCTL(MHCI类分子单高表达U251细胞，经灭活制成的细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞)、HSPCTL(膜型HSP70分子单高表达U251细胞，经灭活制成的细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞)、MHCHSPCTL(膜型HSP70及MHCI双高表达的U251细胞，经灭活制成高免疫原性细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞)及WCTL(野生型U251细胞直接灭活制成的细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞)，7 d后以密度梯度离心法去除瘤苗获得效应细胞。

　　1.2.2 MTT比色法检测效应细胞体外特异性杀伤活性 将上述4种效应细胞分为4组即MHCCTL组、HSPCTL组、MHCHSPCTL组及WCTL组与靶细胞按比例加于96孔板中，每孔200 μL，不足部分加含10%小牛血清RPMI1640培养液，每个处理孔设3个复孔，其中靶细胞浓度为1×105mL-1效应细胞浓度为1×106 mL-1。培养培养24 h后加入MTT液37 ℃孵育4 h，弃上清，加入DMSO充分振荡，于96孔酶标仪上490 nm波长测其D值。靶细胞为U251野生型[w(t)]。效靶比率为50∶1。

　　1.2.3 靶细胞受攻击后超微结构 经效应细胞攻击后的靶细胞离心沉淀，经3%戊二醛1.5%多聚甲醛0.1 mol/L PBS (pH7.2)4 ℃固定数天或数小时;1%锇酸1.5%亚铁氰化钾后固定1.5 h;PBS漂洗;70%酒精饱和醋酸铀染液4 ℃过夜、酒精丙酮脱水，环氧树脂618包埋。超薄切片机切80 nm，经醋酸铀、柠檬酸铅分别染色5 min;在日立Hu12A型透射电镜下观察并摄片。

　　1.3 统计学处理 测定结果数据以x±s表示，应用SPSS 11.5软件对检测数据进行统计学处理，各实验组杀伤活性的两两之间比较行t检验。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MTT比色法检测结果 WCTL、MHCCTL、HSPCTL及MHCHSPCTL组对野生型U251细胞的杀伤率分别为：(13.84±5.70)%，(58.50±5.05)%，(63.28±4.91)%，(78.31±4.56)%;MHCHSPCTL组、HSPCTL组、MHCCTL组和WCTL组两两之间对野生型U251的细胞毒性杀伤率的比较具有统计学意义(P<0.05)，其中以MHCHSPCTL组的杀伤率最高[(78.31±4.56)%];WCTL的杀伤率最低[(13.84±5.70)%]。

　　2.2 透射电镜观察结果 透射电镜发现未受攻击的肿瘤细胞生长状态良好，胞膜上可见微绒毛(图1)，3种效应细胞攻击后的靶细胞出现不同种程度凋亡和的胀亡样表现。凋亡细胞核染色质凝集成块状边聚集于核膜下或核固缩，但本实验尚未观察到典型的凋亡细胞及凋亡小体形成(图2);胀亡细胞表现为胞体增大，肿胀;胞质空泡化;内质网肿胀;线粒体脊变短甚至消失;胞核内染色质分散，凝集在核膜或核仁周围，细胞核有伪足伸出，最后细胞崩解，核溶解(图3)。有些受攻击的细胞具有凋亡样细胞及胀亡样细胞两种混合形态学表现。坏死细胞表现为胞体变小，胞浆基质密度增加，核固缩，染色质呈片状聚集于核膜下(图4)。 在MHCCTL、HSPCTL攻击组靶细胞可见凋亡样坏死，也可见少量胀亡样坏死;MHCHSP CTL攻击组靶细胞胀亡样坏死较多见，部分为凋亡样细胞及胀亡样细胞两种混合形态学表现。

　　3 讨 论

　　本组实验结果显示，MHCHSPCTL组对野生型人脑胶质瘤细胞的细胞毒性明显高于HSPCTL、MHCCTL及WCTL组(P<0.05)，笔者推测HSP70和MHCI类分子双高表达相对于可将低细胞胀亡样坏死：细胞质基质密度下降,内质网扩张,线粒体肿胀, 嵴变短,甚至消失,染色质凝集成块状聚集于核膜下,核膜破裂,不完整. 免疫原性的人脑胶质瘤细胞胞内的免疫原性肽以HSP肽复合物的形式和MHCI肽复合物的双重形式表达于细胞膜上，一方面能够与树突状细胞(dendritic cells, DCs)及单核细胞/巨噬细胞上的CD91(α2巨球蛋白受体)等受体结合，促APCs成熟及活化,进而引发特异性的CD8+T细胞反应[5]，另一方面又可通过肿瘤细胞自身作为抗原递呈细胞的作用以MHCI肽复合物的形式表达于细胞膜上供效应性T细胞识别。其具有双重激活免疫系统机制，且这双重机制所产生叠加/协同作用可产生强大的杀瘤作用，明显优于HSP70或MHCI类分子高表达GBM U251细胞疫苗。

　　透射电镜发现效应细胞攻击后的靶细胞出现两种不同坏死表现即凋亡样坏死和胀亡样坏死。凋亡和胀亡代表了两种不同的细胞死亡方式。细胞凋亡是细胞的主动死亡过程，其从启动到结束都是在基因的严密调控下进行的，基本形态特征表现为细胞萎缩。而细胞胀亡是一种无规律的细胞死亡，是细胞缺乏ATP的被动死亡过程，其发生与基因调控关系尚不明确。基本形态态特征表现为细胞的肿胀。坏死是指细胞死亡后发生的形成学改变，包括核浓缩、核碎裂、核溶解及胞质浓缩、强嗜酸性、结构崩解等一系列变化，至少可由细胞凋亡和细胞胀亡2种不同途径引发。坏死前细胞表现凋亡特征称为凋亡样坏死，若表现为胀亡特征，则称为胀亡样坏死。这两种方式的坏死在形态上往往很难区别[6]。在细胞功能状态一定的情况下，高强度长时间的刺激可能会诱导细胞胀亡，低强度短时间的刺激则会促进细胞凋亡[7]。电镜观察到在MHCCTL、HSPCTL攻击组靶细胞可见凋亡样坏死，少量胀亡样坏死;MHCHSP CTL攻击组靶细胞胀亡样坏死较多见，部分为凋亡样细胞及胀亡样细胞两种混合形态学表现。由此可见MHCHSPCTL对于靶细胞的细胞毒性明显大于MHC CTL及HSPCTL。

　　本研究所观察到靶细胞胀亡样坏死超微结构变化与文献报道的一致，胀亡细胞体积变大、肿胀，胞膜局部向外膨隆，甚至形成泡状，类似凋亡细胞的亚铃样起泡结构，但内无亚细胞器，胞膜的完整性可被破坏;胞质空泡化;内质网肿胀;核膜起泡膜下可聚集有团块状染色质，染色质多分散或凝集成团块状的染色体，分布在核仁周围或核膜下，最终细胞呈现溶解性细胞坏死外观，胞内容物溶解，外溢[89]。

　　这些靶细胞受攻击后超微结构的变化提示着MHCHSPCTL组对野生型靶细胞的细胞毒性明显大于MHCCTL组及HSPCTL组，从靶细胞超微结构变化差异证实了HSP70和MHCI类分子双高表达的U251人脑胶质瘤细胞疫苗具有高免疫原性，同时也从另一方面说明了介导细胞胀亡是HSP70和MHCI类分子双高表达疫苗的U251细胞疫苗一种重要主动特异性抗瘤机制。

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