洛美利嗪对喹啉酸致海马神经元损伤的保护作用

　　作者：朱钦龙　罗坚　曾碧芳　温汉新　罗伟仁 作者单位：广东省深圳市横岗人民医院神经外科，广东深圳 518115;广东医学院病理教研室，广东湛江 524023

　　【摘要】目的：利用洛美利嗪(LOM)研究钙离子拮抗剂对兴奋性氨基酸喹啉酸(QA)所致体外培养海马神经元损伤是否有保护作用。方法：原代海马神经元与QA共同培养建立兴奋毒损伤细胞模型，观察1.2×10-6mol/L，1.2×10-7mol/L，1.2×10-8mol/L 3个剂量LOM对培养神经元的形态学、乳酸脱氢酶(LDH)、细胞存活率的影响。结果：LOM可提高QA损伤的海马神经元细胞存活率，减少LDH 释放，与模型组比较差异有显著性(P<0.01)，并能减轻神经元的病理形态学损伤。结论：LOM 对QA所致的海马神经元损伤有明显的保护作用，而QA所引起的兴奋毒性可能与Ca2+超载所造成的链式损伤有关。

　　【关键词】 海马神经元;洛美利嗪;喹啉酸

　　Lomerizine protects the hippocampus neurons cultured in vitro from the injury caused by quinolinic acid

　　ZHU Qinlong, LOU Jian, ZENG Bifang, WEN Hanxin and LUO Weiren

　　(The People's Hospital of Henggang, Shenzhen, Guangdong 518115, China)

　　【Abstract】Objective：To study if Lomerizine (LOM) protects the hippocampus neurons cultured in vitro from the injury caused by quinolinic acid (QA). Methods：The model of neurons injured by QA was established by coculturing hippocampus neurons with QA. The morphological change, LDH and cell survival rate were examined after adding LOM into the medium with concentrations at 1.2×10-6mol/L,1.2×10-7mol/L,1.2×10-8mol/L. Results：LOM increased the survival rate of hippocampus neurons injured by QA, diminished the release of LDH and improved the pathological morphology, with significant difference from those of the control (P<0.01). Conclusion：LOM could remarkably protect the hippocampus cells from the damage of QA.

　　【Key words】 hippocampus neurons; Lomerizine; quinolinic acid

　　近年来，大量实验研究证实许多神经精神疾病都与过量谷氨酸或其类似物的神经毒性或称兴奋毒性作用有关，如脑外伤、脑缺血缺氧、癫痫、Parkinson 病、Huntington 舞蹈病等[13]，而兴奋毒损伤与Ca2+大量内流致细胞内Ca2+超载所引发的链式损伤有关[45]。洛美利嗪(LOM)是一种新型的二苯哌嗪类钙通道阻滞剂，可选择性地阻断Ca2+过量内流，防止细胞内“钙超载”造成的病理状态和损害，临床上广泛用于治疗脑血管疾病[6]。本研究通过原代海马神经元与QA共同培养建立兴奋毒损伤细胞模型，旨在观察不同浓度LOM对培养神经元的细胞存活率、LDH 活性及其病理形态学改变的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　采用广东医学院实验动物中心提供的新生24h之内雌性的SPF大鼠，DMEM/ F12等购自Hyclone 公司, LOM等购自Nippon Organon公司，喹啉酸(QA)等为Aldrich化学公司产品。本实验于2005年6月至2005年8月在广东医学院病理教研室和深圳市横岗人民医院病理科及实验室完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 海马神经元体外培养方法 新生SPF大鼠(0～1d)，断头后在手术显微镜下快速剥离双侧完整海马，加入5倍体积的0.25%胰蛋白酶，消化30min后吹打,取上清细胞悬液，调整细胞密度为1×106个/mL。吸取不同体积分别接种于预先用多聚赖氨酸处理过的96孔培养板和放有载玻片的24孔培养板中，放入37℃、5% CO2(体积分数)培养箱中培养。

　　1.2.2 体外培养海马神经元兴奋毒损伤模型 海马神经元培养至14 d时，全量换无血清低糖培养液，模型组并加入QA(100μ mol/L)，LOM组同时加入QA(100μ mol/L)和LOM(又分 1.2×10-6mol/L，1.2×10-7mol/L，1.2×10-8mol/L 3个剂量)，阳性药对照组同时加入 QA(100μ mol/L)和 Nim(10μ mol/L)。在与处理因素共培养 24 h后，作指标检测。

　　1.2.3 细胞存活率的计算 采用四氮唑盐(MTT)比色实验法。接种于96孔板的神经元，，每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，37℃继续培养。4h后终止培养，每孔加入150μL二甲基亚砜，震荡器震荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶标检测仪上测定各孔的吸光度值(OD值)。

　　1.2.4 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 接种于24孔培养板的神经元按照LDH测试试剂盒说明书具体操作步骤检测各组上清液中LDH的活性。酶活力单位定义：每克组织蛋白37℃与基质作用15min，在反应体系中产生1μ mol丙酮酸为1单位。其计算公式为：LDH活力 =(测定管OD值-测定空白管OD值)/ (标准管OD值-标准空白管OD值)×2μ mol/mL÷蛋白质量浓度(g/L)

　　1.2.5 神经元病理形态学观察 取出已收集培养液上清的24孔培养板中长有神经元的载片，PBS冲洗后，用中性树胶固定在玻片上，放入-70℃冰柜保存。染色前用4%多聚甲醛固定1h，再用PBS冲洗3次。然后进行HE染色，光镜下观察神经元的病理形态学变化。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据结果均以x[TX-〗±s表示，以SAS软件系统进行单因素方差分析及q检验。

　　2 结果

　　2.1 形态学观察结果

　　细胞切片HE染色后，光镜下观察可见正常组海马神经元胞体大，发亮，呈锥体形。核大，呈圆形，核仁明显，有的呈双核。胞体有双极或多极突起，分支很多，粗大，突起交织成网状，形成神经细胞网络，见图1。加入QA后神经细胞变稀疏，极度萎缩, 胞核固缩，碎裂甚或溶解胞浆嗜酸性改变，染成红色，神经突起断裂，见图2。加入LOM或 Nim后，细胞形态得到改善，见图3、4。 图1 正常组原代海马神经元(HE，×100);图2 模型组原代海马神经元(HE，×100);图3 Nim(10 μmol/L) 组原代海马神经元(HE，×100);图4 LOM (1.2×10-6mol/L) 组原代海马神经元(HE，×100)

　　2.2 细胞存活率测定结果

　　如表1中MTT实验各组吸光度值所示，模型组海马神经元在与QA共同培养24 h后，细胞吸光度值较正常组明显降低(P<0.01)。而Nim(10μ mol/L)和LOM(1.2×10-6mol/L，1.2×10-7mol/L, 1.2×10-8mol/L)可升高QA损伤后海马神经元的吸光度值，与模型组比较差异均有显著性(P<0.01)，且LOM 3个剂量组之间差异亦有显著性(P<0.01)。

　　表1 LOM对QA损伤原代海马神经元OD值的影响(略)

　　组间两两比较：除AvsC、AvsD、CvsD，P>0.05外，余P均<0.01。

　　2.3 LDH测定结果

　　由表 2 可以看出，原代海马神经元与QA共培养后，其上清液中LDH活性明显增加，而LOM则可使QA损伤的海马神经元上清液中的LDH活性降低，Nim使海马神经元上清液中的LDH活性下降，该效应与模型组比较有显著性差异(P<0.01)，且LOM 3个剂量组之间差异亦有显著性(P<0.01)。而Nim(10μ mol/L)组与LOM (1.2×10-6mol/L)组比较差异无显著性(P>0.05)。

　　表2 LOM对QA损伤原代海马神经元LDH活性的影响(略)

　　组间两两比较：除CvsD，P>0.05外，余P均<0.01。

　　3 讨论

　　多种神经精神疾病都与过量Glu或其类似物的神经毒性或称兴奋毒性作用有关。QA是脑内潜在的内源性兴奋性毒素，海马是对QA神经毒性最敏感的脑区，过量的QA激活NMDA受体，引起 Ca2+内流，Ca2+在细胞内积聚可激活磷脂酶和蛋白酶等，造成一系列细胞的链式损伤，破坏细胞超微结构，同时又可刺激 Glu 的释放，形成恶性循环，最终导致神经元的死亡[79]。

　　LOM为一种新型的二苯哌嗪类钙通道阻滞剂，其特点为仅对病理性过多的Ca2+内流有阻滞作用，而对生理性 Ca2+内流无作用，即可选择性地阻断Ca2+过量内流，防止细胞内“钙超载”而造成的病理状态和损害[56] ;也能改善脑及冠脉循环，临床上广泛用于治疗脑血管疾病。有实验表明，LOM可阻断胎鼠大脑细胞内钙含量的增加，对神经毒剂所致的离体脑皮层神经元损伤有保护作用[10]。

　　我们在实验中发现，海马神经元与QA共同培养后，MTT实验其细胞吸光度值明显降低，说明细胞存活率明显降低。上清液中LDH活性增加，神经细胞胞体、胞核和突起均出现明显病理改变，这均说明QA导致了海马神经元的严重损伤。而3个剂量的 LOM(1.2×10-6mol/L，1.2×10-7mol/L，1.2×10-8mol/L)均能提高QA损伤海马神经元的OD值，使神经细胞培养上清液中LDH活性降低，与模型组比较差异均有显著性(P<0.01)，并减轻其病理形态学损伤，提示LOM能提高神经元存活率，并能改善其病理损伤。

　　LOM对QA导致的海马神经元损伤有显著的保护作用，我们推测其保护作用主要仍旧与其拮抗钙通道和钙调蛋白，从而减轻钙超载所造成的链式损伤有关;但具体影响了此链式环节中的哪些相关因素或者是否还通过其他环节而达到其保护作用，尚待我们下一步的实验探讨。

　　【参考文献】

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