Synphilin1寡核苷酸对帕金森病酪氨酸羟化酶表达的影响

　　作者：谢安木 薛莉 刘焯霖 作者单位：青岛大学医学院附属医院神经内科，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 探讨Synphilin1对帕金森病(PD)酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法 50只SD大鼠随机分成5组，每组10只。PD组大鼠右侧黑质注入6羟多巴3 μL制作PD模型，反义组、同义组、错义组分别注入Synphilin1反义寡核苷酸、同义寡核苷酸、错义寡核苷酸各3 μL， 正常对照组右侧黑质注入2 g/L抗坏血酸生理盐水。取鼠的术侧脑黑质制作切片，利用免疫组化方法检测Synphilin1表达，利用免疫组化、Western blot、原位杂交方法检测TH的表达。结果 与正常对照组比较，PD组Synphilin1蛋白表达显著增加，TH蛋白和TH mRNA表达显著减少;与PD组比较，Synphilin1反义组TH蛋白和TH mRNA表达显著增多。结论 Synphilin1可能通过影响TH的表达对帕金森病的发病机制产生影响。

　　【关键词】 Synphilin1 酪氨酸单氧化酶 帕金森病 大鼠

　　THE INFLUENCE OF Synphilin1 OLIGONUCLEOTIDE ON TYROSINE HYDROXYLASE IN PARKINSON DISEASEXIE ANMU, XUE LI, LIU ZHUOLIN(Department of Neurology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of synphilin1 on tyrosine hydroxylase (TH) expression of Parkinson disease. MethodsFifty healthy male SpragueDawley rats were divided evenly into five groups. PD group: PD models were made by unilateral stereotaxic infusion of 3 μL of 6hydroxydopamine (6OHDA) in right substantia nigra. Antisense group, sense group and missense group were given antisense, sense, and missense oligonucleotides respectively. Control group: natrium saline was injected into right substantia nigra. The expression of synphilin1 protein was detected by immunohistochemistry, and expression of TH protein and mRNA immunohistochemistry, western blot, and in situ hybridization. ResultsCompared with control group group, the expression of synphilin1 in PD significantly increased, and the expression of TH decreased. Compared with PD group, the expression of TH protein and TH mRNA in antisense group significantly increased. ConclusionSynphilin1 may affect the pathogenesis of PD by affecting the TH expression.

　　[KEY WORDS]synphilin1; tyrosine3monooxygenase; Parkinson disease; rats

　　帕金森病(PD)是遗传易感性和环境因素共同作用的结果，其主要的病理改变是黑质Lewy小体(LB)形成和神经元缺失。已有文献表明，αsynuclein蛋白是LB的主要成分[1]，该蛋白的聚集和异常表达，对LB的形成及PD的发生均具有重要意义[2，3]。1999年有人在LB中发现另一个蛋白，它能与αsynuclein蛋白相互作用，命名为Synphilin1[4]，推测它在PD的发病机制中可能具有重要意义。本文应用PD动物模型，研究该蛋白异常表达对酪氨酸羟化酶(TH)的影响，以探讨它在PD发病机制中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物分组及处理方法

　　选择50只健康的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(购自广东省医学实验动物中心及中山大学实验动物中心)，体质量210～240 g。随机分成PD组、反义组、同义组、错义组、正常对照组, 每组10只。PD大鼠模型的制备如下：100 g/L水合氯醛(3～4 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉大鼠，参照鼠脑立体定向图谱[5]，将大鼠固定在脑立体定向仪上，剪去头顶部毛，局部消毒，在正中从前向后切开大鼠头顶皮肤，分离颅骨表面的软组织，暴露右侧顶骨。以前囟为坐标原点，对右侧黑质定位，其坐标为：前囟后5.0 mm,矢状缝右侧1.5 mm,颅骨骨面下8.8 mm。PD组右侧黑质用微量注射器注入6羟多巴(6OHDA)18 μg(3 μL),注射速度为1 μL /min, 术毕留针10 min。反义组连续2 d注入Synphilin1反义寡核苷酸3 μL,第3天注入6OHDA 3 μL;错义组注入Synphilin1错义寡核苷酸代替反义寡核苷酸;正义组注入Synphilin1正义寡核苷酸代替反义寡核苷酸;正常对照组黑质内注入2 g/L抗坏血酸生理盐水混合液3 μL。各组均在术后第4周采用100 g/L水合氯醛(5 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉，快速断头取脑，切除右侧中脑腹侧制作标本，冷冻，切片。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 Synphilin1寡核苷酸(ODN)的设计和合成参照Genbank提供的大鼠Synphilin1 mRNA序列，设计了跨越Synphilin1 mRNA翻译起始区和编码区的两条反义寡核苷酸，分别为Antisense 1(AS1)：5′TCAGGGGCTTCCATTATTCT3′, Antisense 2(AS2)：5′GGGATGGTCTTGAGAGAGGT3′，经PCRDESN软件分析两条反义寡核苷酸之间无发夹结构、互补结构。同时设计相应的正义寡核苷酸和错义寡核苷酸作为对照，序列分别如下。正义：5′AGAATAATGGAAGCCCCTGA3′， 错义：5′GAATAAATAAGGCGCCTCAG3′。由武汉博士德公司合成。

　　1.2.2 Synphilin1、TH蛋白表达的定性检测 采用免疫组化法检测Synphilin1、TH蛋白表达。首先制备石蜡包埋切片，片厚5 μm,抗体购自Chemicon公司，严格按照试剂盒说明书操作，TH按1∶4 000稀释，Synphilin1按1∶3 000稀释，采用ABC法染色。每个标本在高倍镜(200倍)下观察，随机取3个视野，采用德国KONTRON IBAS 2.0 全自动图像分析系统，分别计数Synphilin1、TH阳性细胞数。

　　1.2.3 TH蛋白表达的半定量检测 采用Western blot方法，首先采用三去污剂裂解缓冲液提取术侧中脑腹侧的总蛋白，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，抗体孵育，曝光。采用德国KONTRON IBAS 2.5 全自动图像分析系统分析结果。所用抗体购自Chemicon公司。

　　1.2.4 TH mRNA表达的检测 采用原位杂交方法，地高辛标记的多项寡核苷酸探针及地高辛检测试剂盒均购于武汉博士德公司，TH原位杂交探针序列为：5′GTTTG AGACA TTTGA AGCCA AAATC CACCA3′(大鼠);以杂交液中不加地高辛标记的探针作为阴性对照。严格按照试剂盒说明书进行操作，采用ABC法染色。每个标本在高倍镜下(200倍)观察，并随机取5个视野，采用德国KONTRON IBAS 2.0 全自动图像分析系统，计数TH mRNA表达阳性细胞数。

　　1.3 统计学处理

　　采用SSPS软件进行统计学处理，数据间比较采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组Synphilin1蛋白表达比较

　　正常对照组、PD组、反义组、正义组、错义组Synphilin1免疫组化阳性细胞数分别为98.15±26.12、153.50±13.89、 108.50±26.75、 146.75±21.18、 153.00±18.23个。与正常对照组比较，PD组、正义组、错义组Synphilin1阳性细胞数显著增多，差异有显著性(F=5.963，q=4.36～5.10，P<0.05);反义组差异无显著性。

　　2.2 各组TH蛋白表达免疫组化检测结果(IH)及其比较

　　与正常对照组比较，PD组、正义组和错义组TH阳性细胞数显著减少，差异有显著性。与PD组比较，反义组TH阳性细胞数显著增多，差异有显著性;正义组、错义组无明显差异。见表1。

　　2.3 各组TH mRNA表达原位杂交检测结果及其(ISH)比较

　　与正常对照组比较，PD组、正义组和错义组TH阳性细胞数显著减少，反义组未见减少。与PD组比较，反义组TH阳性细胞数显著增多，正义组、错义组无明显差异。说明PD时TH的表达减少，Synphilin1反义寡核苷酸阻断能够提高TH的表达。见表1。表1 各组TH免疫组化和原位杂交阳性细胞计数及其比较与正常对照组比较, F=5.984 、13.188，*q=6.25～8.20,P<0.01; 与PD组比较， △q=4.13, P<0.05 ; △△ q=5.77, P<0.01

　　2.4 各组TH蛋白表达Western blot半定量检测结果比较 正常对照组、PD组、反义组、正义组、错义组TH蛋白半定量检测结果分别为902.51±62.93、614.13±57.58、980.83±102.28、730.13±90.52、584.65±88.36，与正常对照组比较，PD组、正义组和错义组TH表达量显著减少，差异有显著性(F=13.556，q=3.63～6.70,P<0.05、0.01);反义组差异无显著性。与PD组比较，反义组TH表达量显著增多(q=4.13, P<0.01)，正义组、错义组无显著差异。

　　3 讨 论

　　ENGELENDER等[4]于1999年在筛选αsynuclein蛋白相互作用物时发现，在LB中有一蛋白与αsynuclein蛋白相互作用，命名为Synphilin1。研究表明，PD病人αsynuclein蛋白在脑内异常聚集，并形成PD特征性的病理表现LB的主要成分，由此认为该蛋白在PD的发病机制中具有重要意义[6]。因此，研究与αsynuclein蛋白相互作用的蛋白synphilin1表达，对于研究PD的发病机制具有重要意义。本研究利用免疫组化法研究显示，PD组黑质Synphilin1阳性神经元数比正常组明显增多，提示6OHDA可能通过促进该蛋白的高表达而导致多巴胺神经元死亡，推测Synphilin1参与PD的发病机制，但具体作用机制有待深入的研究。

　　TH是DA合成的限速酶，TH的增加和减少直接影响着DA的含量。许多研究已经证明，PD时TH明显减少。本研究利用免疫组化法及Western blot定量检测显示，PD组TH的表达明显下降，与相关文献报道一致[7～9];原位杂交检测显示TH mRNA的表达在PD组明显下降，说明TH在分子水平就有改变，进一步证明TH下降导致DA含量下降，从而导致PD症状的出现。然而，Synphilin1蛋白的高表达与TH是否有关，以及Synphilin1在6OHDA 诱导的PD发病机制中的作用是否与TH有关有待进一步研究。

　　反义寡核苷酸通过序列特异地与靶mRNA结合而抑制基因表达, 从而成为一类理想的、基因水平调控的治疗药物[10]。因具有较好的抗酶解活性,寡核苷酸硫代磷酸酯已成为目前最广泛研究的寡核苷酸类似物之一,并已应用于临床[11]。本文设计了正义、错义、反义3种寡核苷酸，注入大鼠右侧黑质，然后再在黑质内注入6OHDA，分别应用免疫组化、Western blot、原位杂交法检测TH阳性细胞数，结果显示，与PD组比较，反义组术侧黑质的TH阳性细胞数显著增多，蛋白显著增多，mRNA表达阳性细胞数也显著增多，而正义组、错义组与PD组比较差异无显著性，说明PD模型黑质Synphilin1高表达的抑制，可以提高TH蛋白的表达，进一步说明Synphilin1反义寡核苷酸能够抑制PD黑质神经元的损伤;另一方面说明了Synphilin1对PD的作用机制之一可能是通过减少TH的表达来实现的。由此我们认为它与αsynuclein相互作用共同参与了PD的发病机制。

　　【参考文献】

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　　[2]POLYMEROPOLOS M H, LAVEDAN C, LEROY E, et al. Mutation in the alphasynuclein gene identified in families with Parkinsons disease[J]. Science, 1997,276 (5321):20452047.

　　[3]KRUGER R, KUHN W, MULLER T, et al. Ala 39 Pro mutation in the gene encoding αsynuclein in Parkinsons disease[J]. Nature Genet, 1998,18(2):106108.

　　[4]ENGELENDER S, KAMINSKY Z, GUO X, et al. Synphilin1 associates with alphasynuclein and promotes the formation of cytosolic inclusions[J]. Nat Genet, 1999, 22(1):110114.

　　[5]包新民，舒斯云. 大鼠脑立体定向图谱[M]. 北京：人民卫生出版社， 1991:4958.

　　[6]CHOI J Y, SUNG Y M, PARK H J, et al. Rapid purification and analysis of alphasynuclein proteins: Cterminal truncation promotes the conversion of alphasynuclein into a proteasesensitive form in Escherichia coli[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2002,36(Pt 1):3340.

　　[7]彭湘闽，蒋雨平. 酪氨酸羟化酶与帕金森病[J]. 中国临床神经科学, 2002，10(1)：105108.

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　　[10]CROOKE S T, BENNETT C F. Progress in antisense oligonucleotides therapeutics[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1996,36(1 ):107129.

　　[11]AGRAWAL S. Antisense oligonucleotides: towards clinical trials[J]. Trends Biotech, 1996,14(10):376387.