分化抑制因子Id1与恶性肿瘤血管生成的研究进展

　　作者：张涛 综述, 江普查 审校 作者单位：武汉大学1第二临床学院2007级;2中南医院神经外科,湖北 武汉

　　【关键词】 分化抑制因子Id1;恶性肿瘤;肿瘤血管生成

　　分化抑制因子Id1属于HLH蛋白家族,其4种同源系列Id1、Id2、Id3 及Id4均可与碱性HLH蛋白(basic helixoophelix，bHLH)作用,阻碍bHLH和DNA的结合, 影响特异蛋白的表达、抑制细胞的分化，故又被称为DNA结合抑制因子[1](inhibitors of DNA binding)。近年来研究显示Id1蛋白作用于多种信号途径而参与人类恶性肿瘤的发生发展，特别是与一些下游效应分子结合而具有潜在癌蛋白属性，尤其是Id1蛋白"缺失/获得"的研究有人已经将其列为准癌基因[2]。随着Id1蛋白促进肿瘤发生发展侵袭转移的相关分子机制深入研究，Id蛋白靶向治疗恶性肿瘤也越来越受到人们的关注，本文就Id1在恶性肿瘤血管生成方面综述如下。

　　1 分化抑制因子Id1的生物学特征

　　Id蛋白是Benezra等[3]于1990年首先从鼠红白血病细胞cDNA文库中克隆，属于HLH反式作用因子家族，其结构包括两个保守性较高的由15～20个氨基酸残基组成的a螺旋，中间以长度不定保守性差的拌环(loop)区段相隔。大多数HLH 蛋白属于碱性HLH(bHLH)家族成员，包括高度保守的HLH结构域和碱性DNA结合区。多数转录因子可通过碱性DNA结合区通过与DNA上E框基序(CANNTG)或相关N框基序(CACNAG)结合发挥转录激活或抑制作用调控基因的表达[4-5]。而Id蛋白缺乏碱性DNA结合区，主要与bHLH 形成Id-HLH异二聚体不能结合DNA，但可竞争性抑制bHLH与DNA及其他组织特异性bHLH转录因子结合，发挥抑制细胞分化等作用。因此Id蛋白作为bHLH转录因子主要抑制因子发挥重要的作用。此外Id蛋白也能与非HLH蛋白，如Rb、Ets结构域转录因子、同源盒家族转录因子Pax、小鼠Id相关蛋白(MIDAq)等相互作用表现其生物学活性。

　　Id蛋白家族广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子负性调控蛋白，由位于不同染色体上的4种Id基因所编码，即20p1 、2p25 、1p36 和6p22～21上，它们都具有两条兼性a-螺旋所组成的高度保守的HLH同源结构域，在两条a螺旋之间有一个环状结构的非保守序列，该序列的长度和氨基酸排列顺序在不同的ld蛋白中存在着较大的差异。Id蛋白分子量在13～20 Kb左右，半衰期20～60 min，主要是通过泛素-蛋白酶体途径降解。小鼠Id1蛋白是由164个氨基酸残基组成的单链多肽,基因定位在2号染色体上;人Id1蛋白是由155个氨基酸残基组成的单链多肽,基因非常靠近着丝点，定位在20p1,在扩增子外有2个外显子(426 bp5'端外显子和42 bp3'端外显子)被一个内显子(239 bp)分开，Idl转录起始于起始点在AUG 96 bp的上游区，其准确定位有待进一步研究[6]。

　　2 Id1蛋白的组织分布及表达

　　几乎所有的细胞都至少表达一种Id基因,更多的时候是同时表达多个Id基因。正常细胞内Id类蛋白量随着细胞分化过程而逐渐降低[7]。细胞增殖越旺盛,Id基因表达量越高,而处于静止状态或已经终端分化的细胞中则表达量很低甚至检测不到。大量实验证实在不同细胞系的不同发育阶段,Id蛋白的表达不一且Id家族成员亦表现出不同的特性,提示这个蛋白家族可能有较强的组织特异性和复杂的时间特异性。如Idl高度表达于胚胎至原肠胚形成阶段的几乎所有区域，胚胎干细胞中Idl和Id4表达丰富，在胚胎第9.5～11.5 d Idl表达于心室区未分化的神经元前体，成年脑、睾丸和骨髓4种Id基因均有表达。有人在研究B淋巴细胞发育过程中Id蛋白表达情况时，发现Id基因在原B细胞、前B细胞和B细胞中均无表达，只在很早期的造血祖细胞系中表达。类似结论也在动物细胞上得到了验证，如：小鼠胚胎发育全过程中Id基因在发育初期细胞高表达，接近终末分化的细胞Id基因表达量极少[8]。

　　原位杂交(ISH)、免疫组化(IHC)、免疫印迹(NBT)等技术发现在人体肿瘤组织及体外培养的肿瘤细胞中，Id蛋白家族均有异常的表达。且与其他成员相比，Id1在多种肿瘤中过表达现象更为普遍[9]。如头颈部鳞癌、鼻咽癌、甲状腺癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、尤文氏肉瘤、精原细胞瘤、早期黑色素瘤、白血病等[10-15]均有高表达，而在对照组织中低表达或阴性表达，同时指出Id1基因高表达，是侵袭性肿瘤表型、预后差的标志物。还有人已将Idl作为新的肿瘤标志在宫颈癌、肝癌、前列腺癌中应用于临床常规检验[16]。多数研究[17]认为Id1分子主要定位于胞浆，但有文献报道当共转染Id蛋白的结合靶分子E-蛋白(如E47)，Id蛋白与E-蛋白形成的二聚体会借助E-蛋白上的核定位信号发生核转位，定位于细胞核。还有研究表明Id1可定位于中心体，并与中心体数目的异常有关，由此导致基因组的不稳定和肿瘤的发生[18]。

　　3 Id1与肿瘤血管生成

　　Folkman[19]在1971年首先提出了肿瘤生长依赖于血管形成的学说，事实上血管生成不仅是肿瘤生长所必需，而且是肿瘤细胞与新生血管系统的接触最终导致肿瘤侵袭和远处转移的原因。在肿瘤大小不超过数个立方毫米时并没有肿瘤血管生成，称为无血管期;当进入血管期，肿瘤组织就会迅速生长，同时造成肿瘤侵袭和转移。这个过程通常包括血管生成表型形成，基质膜的降解，内皮细胞迁移、增殖，管腔网状结构形成等，是由多种生长因子、胞外基质组分和其他相关的酶类参与[20]。一般认为血管生成可分为：血管的完整性破坏;血管内皮细胞增殖;血管内皮细胞游走;血管结构重建四个连续的步骤[21]。Lyden等[22]研究发现Id1和Id3双敲除的小鼠脑的神经外胚层出现了血管生成缺陷，尤其在前脑的神经节隆起处还观察到明显的脉管膨胀且显现出Flk1(VEGFR2)和VEGF的异常表达;这些既缺失Id1又缺失Id3基因小鼠由于具有血管生成的缺陷，其胚胎平均存活13.5 d。并认为肿瘤血管上Avb3整合素及与其相关的金属蛋白酶MMP2的丢失造成血管生成障碍是肿瘤细胞生长抑制及退化的原因。Lee等[23]在胰腺癌中发现Idl的表达水平越高，肿瘤中的血管密度指数也越高，提示Idl的表达和肿瘤血管发生存在相关性。

　　3.1 Id1是新的促血管生成分子

　　1999年“nature”上首次报道Id1，Id3参与肿瘤血管生成，并指出血管生成依赖蛋白水解作用和细胞外基质的重构。用微阵列分析发现[24]，Idl基因缺失导致促血管生长因子如整合素0c6和整合素B4、基质金属蛋白酶-2和成纤维细胞生长因子受体1表达下调，提示Idl蛋白是调控肿瘤细胞血管形成的重要因子。Benezra等[25]研究敲除Id1的小鼠其内皮细胞周围细胞外基质明显增厚，通过剂量效应分析，得出Id1-/+可使内皮细胞对肿瘤信号的敏感度增加，而Id1-/-其敏感性下降。说明仅仅杂合性的敲除就能导致抑制肿瘤生长，且缺失的基因愈多，肿瘤的生长抑制和新生血管生成障碍就愈明显。

　　3.2 Id1参与肿瘤血管生成的机制

　　Id1作为转录因子的共同作用分子可以发挥双向调节作用，研究发现Id1的高表达可以激活VEGF的转录，抑制血管生成抑制剂TSP1的转录等多种途径促进肿瘤的血管生成。

　　3.2.1 促进VEGF的转录:Ling等[26]发现在前列腺癌细胞中Id1分子过表达，VEGF mRNA和蛋白的表达也增加，并通过报告基因实验证实Id1可以激活VEGF转录，从而促进血管内皮细胞的增殖和管状形成。反之，降低Id1的表达则可抑制VEGF的转录活性。若将Id1siRNA载体转染前列腺癌细胞可导致Id1下调，同时VEGF的转录和分泌也下调;若加入Flk1酶抑制剂或VEGF的中和性抗体抑制VEGF的功能，可阻断Id1诱导的内皮细胞的增殖和管状形成。Daisuke等[27]研究发现，当人类脐静脉内皮细胞加入VEGF或TGFβ时可诱导上调Idl和Id3基因，从而参与肿瘤性血管的形成，这提示Idl和Id3在VEGF信号转导途径中起关键作用。国内李文炼[28]研究发现在结肠癌中Id1蛋白与VEGF蛋白的表达呈正相关，洪天姿[29]发现Id1表达高低与乳腺癌VEGF分泌量正相关，并认为Id1可能通过某种路径影响VEGF表达，影响乳腺癌的侵袭转移与血管生成。目前普遍认为VEGF能结合循环中内皮祖细胞及骨髓祖细胞，而VEGFR诱导Idl及Id3蛋白表达，进而诱导更多与血管内皮细胞募集相关的蛋白，从而参与肿瘤血管生成 。

　　3.3.2 抑制体内最强大的血管生成抑制因子TSP1的转录:有研究发现[27]Id1单纯过表达而无VEGF时，也可诱导脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、活化和血管生成过程，所以Id1的促血管生成作用还有非VEGF依赖的机制。凝血酶敏感蛋白(thrombospondin1，TSP1)是体内强大的血管生成抑制因子，可以诱导内皮细胞凋亡，抑制内皮细胞增殖和迁移而达到抗肿瘤血管生成的作用。Id1高表达可抑制TSP-1的转录，使成纤维细胞生长因子(FGF)和VEGF上调，促进肿瘤血管生成。Volpert等[10]观察到，Id1-/-鼠肿瘤的生长和转移能力下降与TSP1的活性增加相关，并推测Id1-/-和/或Id3-/-鼠在肿瘤血管生成中内皮细胞的募集受阻是由于分泌VEGF的细胞中TSP1的表达增加引起的，并指出Id1能直接与TSP1的启动子(非E-box)结合，也可作为一种新的HLH蛋白调控元件从而促进肿瘤血管生成。可见多数学者认为Id1可以通过抑制体内TSP1的转录而达到抗血管生成的作用。

　　3.2.3 募集血管内皮细胞前体细胞(CEPs):研究表明Id1蛋白在血管内皮细胞募集过程中发挥关键性作用，Lyden等[30]发现，Id1可通过诱导VEGF受体生成更多的与血管内皮细胞募集相关蛋白(MMP-2、整合素等)，使骨髓内皮细胞的前体细胞向肿瘤局部迁移而促进肿瘤血管生成。Arnold等[18]发现Idl和Id3基因双敲除的小鼠出现血管畸形、血管分支和分叉障碍;还发现在Idl或Id3小鼠中，植入异种肿瘤的生长或转移能力都受到明显抑制，肿瘤中新生血管量极少，并伴有大面积坏死，由此推测血管生成缺陷与VEGF依赖的前体内皮细胞(CEPs)从骨髓迁移入新生肿瘤脉管系统的能力受损有关。一般认为CEPs是肿瘤血管形成的重要来源，当肿瘤细胞分泌的某些细胞因子(如促血管生成因子)可趋化循环中的CEP向肿瘤局部定位，导致周围血管的出芽，若VEGF在血浆中水平升高，可以诱导Id1和Id3在骨髓内的上调，为CEPs和造血前体细胞的迁移提供了有利的环境。而在Id1+/-Id3-/-小鼠中，同样发现Id的表达可支持肿瘤的血管生成，并且VEGFR1+骨髓细胞的募集和VEGFR2+循环内皮前体细胞可表达Id1。由此可见Id1参与内皮细胞的激活和血管生成是一个复杂的网络，是多个途径共同作用的结果。

　　4 Id1蛋白研究尚待解决的问题

　　Id1蛋白在恶性肿瘤血管生成中的作用近年备受关注，但目前Id1蛋白与其他蛋白的相互作用机制及调控Id1基因表达的上游因子和Id1蛋白的下游效应子还不完全清楚。目前发现了一些受到Id1蛋白调控的分子，但这些分子与下游执行功能的分子之间的联系以及围绕Id1蛋白的调控网络尚未建立。和大多数肿瘤治疗靶点所面临的问题一样，Id1蛋白作为治疗靶标的治疗手段尚待开发，虽然已尝试了许多方法，但依然存在问题。例如体外针对Id1反义寡核苷酸能够很成功的抑制Id1的表达，但是化学修饰的寡核苷酸毒性限制了其在人体内的应用[31]。另有研究采用重组人内皮抑素腺病毒的肿瘤局部血管基因治疗能抑制肿瘤新生血管形成而有效抑制肿瘤的生长和转移,但其效应有剂量依从性, 且不能完全抑制肿瘤的生长[32]。总之国内外学者正致力于Id1蛋白在人类肿瘤中的分子机制研究，而随着蛋白结构生物学，反义核酸等生化技术发展Id1蛋白有可能成为抗癌药物研究中又一新的靶蛋白，Id蛋白也有可能成为恶性肿瘤诊断和治疗的一种“黄金因子”。

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