颈动脉狭窄与ApoE基因多态性的相关性研究

　　作者：王雁 张见影 董国英 于笑峰 作者单位：青岛大学医学院附属医院神经科，山东 青岛 266003

　　【摘要】目的 研究载脂蛋白E(ApoE)多态性及脂类代谢与颈动脉狭窄的相关性。方法 应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术，对62例经血管造影证实的颈动脉狭窄患者及71例同期健康体检者的ApoE基因多态性进行分析，并进行血脂测定。结果 颈动脉狭窄组胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDLC)水平均升高(P<0.05，P<0.01);颈动脉狭窄组患者的ε3频率较对照组降低(P<0.01)，ε4频率较对照组升高(P<0.01)，两组的基因型频率无差别;不同年龄、性别及颈动脉狭窄程度的患者ApoE多态性分布无差别。结论 ApoE基因多态性与颈动脉狭窄形成及血脂改变有关，ε4基因是颈动脉粥样硬化形成的危险因子。

　　【关键词】 颈动脉狭窄 载脂蛋白E 基因多态性

　　由颈动脉粥样硬化斑块导致的颈动脉狭窄，是引起脑缺血性低灌注和颅内动脉栓塞的主要原因之一〔1〕。载脂蛋白E(ApoE)是血浆中主要载脂蛋白之一，其基因多态性是决定血脂水平进而影响颈动脉粥样硬化病变发生、发展的遗传因素之一。本文对两者之间的关系进行研究。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 颈动脉狭窄组：选取住院病人62例，均经全脑血管造影证实为颈动脉狭窄，其中狭窄≥50% 29例，狭窄<50% 33例;男35例，女27例，平均年龄(65.4±9.5)岁。对照组：71例，为同期在本院门诊健康查体者。无高血压、糖尿病、周围血管病及心脑血管病。

　　1.2 标本采集 所有入选患者禁食12 h后，抽清晨空腹血5 ml，其中2 ml血(EDTA 抗凝)常规提取DNA 进行ApoE基因多态性分析;3 ml血测定血脂、血糖等生化指标。

　　1.3 血脂和载脂蛋白测定 血标本采集后，在同一台Beckman公司 SYNCHRON CX7全自动生化分析仪进行总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDLC)、高密度脂蛋白(HDLC)、载脂蛋白A(ApoA)与载脂蛋白B(ApoB)测定。

　　1.4 ApoE的基因型分析 使用DNA提抽试剂盒常规提取基因组DNA，采用聚合酶链反应扩增ApoE基因片段，引物参考国外文献〔2〕，取ApoE第四外显子中包含编码第112位和158位氨基酸的一段基因序列用于分析ApoE基因多态性，PCR扩增产物为244 bp。引物序列：P1：5′ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC3′;P2：5′TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA3′，引物由上海生工合成。PCR反应体系为50 μl，2×Buffer 25 μl，dNTPs 4 μl，P12 μl，P22 μl，MgCl2 3 μl，Taq酶2.5 U，模板DNA 400 ng以上，二甲基亚砜 5 μl (10%)。反应条件：95℃预变性12 min;变性：95℃ 1 min;退火：60℃ 2 min;延伸：72℃ 2 min。共30个循环，72℃延伸10 min。 扩增产物在244 bp处可看到清晰的条带。再取PCR扩增成功的产物17 μl，加入HhaⅠ限制内切酶5 U，10×Buffer 2 μl，37℃水浴消化4 h以上。将酶切产物置于非变性丙烯酰胺凝胶电泳约4 h。银染法染色，观察结果并拍照。

　　1.5 统计学处理 ApoE基因频率采用频率计数法计算，统计用χ2检验，血脂等采用独立样本的t检验。全部统计分析采用SPSS11.5统计软件。

　　2 结果

　　2.1 颈动脉狭窄组和对照组血脂和载脂蛋白水平比较 颈动脉狭窄组的TC、TG、LDLC水平均较对照组升高(P<0.05); HDLC、ApoA与ApoB的水平两组之间无差别(见表1)。

　　表1 颈动脉狭窄组和对照组血脂和载脂蛋白水平比较(略)

　　2.2 颈动脉狭窄组和对照组ApoE基因型和等位基因频率分布 两组的基因型分布无差别;颈动脉狭窄组的ε3等位基因频率较对照组显著减少(P<0.01)，ε4等位基因频率较对照组显著增加(P<0.01)(见表2、表3)。

　　2.3 颈动脉狭窄组不同年龄和性别等位基因频率分布 不同性别间及年龄≥60岁和<60岁的患者之间等位基因分布无差别(见表4)。

　　2.4 颈动脉狭窄患者按狭窄程度分组后等位基因频率分布 狭窄≥50%的患者和狭窄<50%的患者之间等位基因分布无差别(见表5)。

　　表2 颈动脉狭窄组和对照组ApoE基因型和等位基因频率分布(略)

　　表3 两组ε2、ε3、ε4等位基因频率分布(略)

　　与对照组比较：1)P<0.01

　　表4 不同性别、年龄组颈动脉狭窄组等位基因频率分布(略)

　　表5 轻、重度颈动脉狭窄组ApoE基因型及等位基因频率分布(略)

　　3 讨论

　　ApoE基因位于第19号染色体上,ApoE常见的3种等位基因ε2、ε3、ε4分别编码产生3种主要的ApoE异构体ApoE2、ApoE3和ApoE4。ApoE基因多态性导致人群中存在6种不同基因型,包括3种纯合体(ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4)，3种杂合体(ε2/ε3、ε3/ε4、ε2/ε4)。

　　ApoE在颈动脉粥样硬化中的发病机制具有重要作用。许多研究表明：ε4等位基因与高水平血浆TC、高水平LDLC显著相关;Dallongeville等〔3〕从17个国家45个人群样本分析证实，携带ε4和ε2者较ε3 /3表型者有更低或更高的血浆TC水平。本研究也证实：颈动脉狭窄组存在脂质代谢紊乱，其TC、TG 和LDLC水平均升高，与国内既往的有关脑梗死的报道相一致〔4〕。推测ApoE在颈动脉粥样硬化中发病机制的作用主要表现在：(1)ApoE位于脂蛋白颗粒表面,其与LDL受体的结合对于血浆胆固醇的清除极为重要，ApoE可能影响HDLC，故ApoE基因可通过调节脂蛋白水平影响动脉粥样硬化的形成。(2)通过刺激巨噬细胞、泡沫细胞的形成及作用于脂蛋白的结构蛋白直接参与动脉粥样硬化的形成。

　　近年来对ApoE不同基因型在心脑血管疾病中的作用研究日趋活跃：Kogawa 和Sass〔5，6〕研究显示ε4等位基因与颈动脉内中膜的厚度有关，ε2等位基因携带者的颈动脉内中膜的厚度要明显低于含ε3或ε4者。而Zannad等〔7〕提出ε3等位基因是增加颈动脉粥样硬化的危险因素，与ε4等位基因无关。Topic 等〔8〕发现携带ε3和ε4者颈动脉狭窄的风险性高。本研究结果发现：与对照组相比，颈动脉狭窄组的ε4频率较对照组升高，ε3频率较对照组降低，两组之间等位基因分布无差别。可能因为ε4和较高的LDLC相关，而LDLC的升高易引起动脉粥样硬化和冠心病。在既往的研究中也发现ε4等位基因和冠心病密切相关，与其他基因型比较，ε4等位基因携带者患冠心病的危险增加约40%，并推测这些可能与编码的ApoE4异构体造成的脂蛋白代谢紊乱和血浆TC、TG浓度异常升高有关〔9〕。本研究的发现与此相同，是否ε4在脑血管病中的作用与在冠心病中的作用相同有待进一步研究证实。而颈动脉狭窄者的ε3频率降低，可能说明在某种程度上ε4是颈动脉狭窄的危险因子，ε3是其保护因子;而对既往报道的与冠心病有关的等位基因ε2，本研究未发现两组之间有差别，可能也说明ApoE基因多态性在心脑血管疾病中的作用不完全相同。

　　为观察ApoE基因对狭窄程度的影响，本研究对中度和重度颈动脉狭窄患者进行比较，未发现ApoE等位基因和基因型在两组之间的分布有差别(也可能与样本数量有关)。

　　既往的研究报道，在冠心病患者中，不同年龄和性别ApoE等位基因和基因型的分布存在差异。Nassar等〔10〕的研究发现：年龄<50岁的冠心病患者ε4频率明显高于年龄>65岁的患者，而后者的ε2频率明显高于前者。Ruth等〔11〕研究表明，与ε3/3基因型携带者比较，ε3/2型女性患缺血性心脏病的危险性降低，而ε4/3和ε4/4基因型男性特别易患缺血性心脏病。本研究未发现ApoE多态性在不同的年龄、性别间存在差异，有待于对汉族人群的大样本研究以进一步证实其内在的联系。

　　总之，本研究发现颈动脉狭窄患者存在血脂代谢紊乱，主要表现为TC、TG和LDLC水平升高;颈动脉狭窄患者等位基因ε4频率升高，ε3频率降低，可能说明在某种程度上ε4是颈动脉狭窄的危险因子，而ε3是其保护因子。因此，对人群进行血脂水平和ApoE基因型的检测，有利于对颈动脉粥样硬化的预测和预防。

　　【参考文献】

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　　7 Zannad F，Visvikis S，Gueguen R,et al.Genetics strongly determines the wall thickness of the left and tight carotid arteries〔J〕.Hum Genet，1998;103:1838.

　　8 Topic E，Timundic AM，Ttefanovic M,et al.Polymorphism of apoprotein E (APOE)，methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and paraoxonase (PON1) genes in patients with cerebrovascular disease〔J〕.Clin Chem Lab Med，2001;39(4):34650.

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　　10 Nassar BA，Dunn J，Title LM,et al.Relation of genetic polymorphisms of apolipoprotein E，angiotensin converting enzyme，apolipoprotein B100，and glycoprotein IIIa and earlyonset coronary heart disease〔J〕.Clin Biochem，1999;32(4):27582.

　　11 Ruth FS，Anne TH，Rolf S,et al.ApoE geneotype:epsilon32 women are protected while epsilon43 and epsilon44 men are susceptible to ischemic heart disease.The Copenhagen City Heart Study〔J〕.J Am Coll Cardiol,2000;35(5):11929.