格尔德霉素对肝细胞生长因子引起的人脑胶质瘤细胞增殖与凋亡变化的影响

　　作者：王春辉 李蕴潜 罗毅男 熊文激 韩雪梅 徐松柏 于音 作者单位：吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 研究格尔德霉素(GDM)对肝细胞生长因子(HGF)引起的胶质瘤细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法 U251-MG和U87-MG细胞同步生长后，用HGF作用24 h，加入不同剂量GDM (终浓度为50、250、500与1 000 nmol/L)再处理48 h。MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期时相和细胞凋亡变化。结果 与正常对照组相比，单纯HGF组其U251-MG和U87-MG细胞增殖指数显著增高(P<0.05)，凋亡百分率显著降低(P<0.05);单纯GDM组这两种肿瘤细胞增殖指数显著低于正常细胞(P<0.05)，凋亡细胞百分率显著高于正常组(P<0.05)，且随浓度增加其增殖抑制作用逐渐增强，1 000 nmol/L的GDM对HGF的抑制效果最好;HGF联合不同浓度GDM组其增殖指数则显著高于单纯GDM组，凋亡细胞百分率显著低于GDM组;同时HGF联合不同浓度GDM组其细胞G0/G1期细胞表达百分率显著高于GDM组(P<0.05)，而G2/M期细胞表达百分率显著低于GDM组(P<0.05)。结论 GDM能抑制HGF诱导的胶质瘤细胞的增殖，并促进其凋亡，即GDM 对HGF的增殖促进及凋亡抑制作用具有逆转能力。

　　【关键词】 脑胶质瘤;肝细胞生长因子;格尔德霉素;细胞周期;凋亡

　　脑胶质瘤是神经外科难治疾患之一，发病率较高，预后极差，尽管目前治疗方法有许多种，但疗效都欠佳。近年来研究发现肝细胞因子(HGF)能以自分泌和旁分泌方式促进神经胶质瘤细胞的增殖，并增强其侵袭能力〔1〕，HGF及其受体Met系统作为迁移和侵袭的关键刺激因子，在脑胶质瘤的进展中具有决定性作用。抗肿瘤抗生素格尔德霉素(geldanamycin，GDM)对HGF的抑制效力最显著，是HGF最强的抑制物〔2,3〕。本研究旨在探讨GDM对HGF引起的胶质瘤细胞增殖、周期和凋亡的影响，为临床开展脑胶质瘤治疗提供新的思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养及实验分组 人脑恶性胶质瘤细胞系U251-MG和U87-MG(吉林省肿瘤研究所提供)，用含青、链霉素的DMEM+10%FBS培养，37℃，5%CO2饱和湿度条件下，每2～3 d消化传代，细胞同步生长后，用HGF(终浓度30 ng/ml)作用24 h后，再加入不同剂量GDM(终浓度50、250，500与1 000 nmol/L)再处理48 h，进行细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡检测。实验分组：正常组、单纯HGF、单纯GDM和HGF+GDM组。rhHGF为美国Calbiochem公司产品，GDM用其衍生物17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG)，MTT、二甲基亚砜(DMSO)和PI均购自Sigma公司。

　　1.2 细胞周期检测 收集对数生长期U251-MG和U87-MG细胞，调细胞浓度为1×105个/ml，接种于24孔培养板中，经HGF作用24 h后，按实验分组加入不同浓度GDM，继续培养48 h后，收集细胞，1 200 r/min，离心5 min，0.01 mol/L PBS洗两次，RNA酶消化，PI 4℃避光染色30 min，用流式细胞仪(美国，BD公司)检测细胞周期时相和凋亡变化。

　　1.3 细胞增殖能力检测 收集对数生长期U251-MG和U87-MG细胞，接种于96孔培养板内，细胞数为2×104个/孔，加入HGF作用24 h，加入不同浓度GDM作用48 h后，加入MTT(5 mg/ml)20 μl 继续培养4 h。培养结束后吸弃孔内培养液，加入DMSO 150 μl/孔，振荡混匀10 min，应用酶标仪(Bio-Rad，美国)，于570 nm波长测定A值，各组设6复孔。

　　1.4 统计学分析 数据以x±s表示，应用SPSS 12.0软件包进行方差分析。

　　2 结果

　　2.1 U251-MG细胞周期与凋亡变化 与正常对照组相比，30 ng/ml的HGF作用24 h后，U251-MG细胞G0/G1期细胞百分率显著增加(P<0.05)，而G2/M期细胞及凋亡百分率显著降低(P<0.05);与HGF组相比，不同浓度GDM单独作用U251-MG细胞，其G2/M期细胞及凋亡细胞百分率均显著增多(P<0.05)，G0/G1期细胞百分率显著降低(P<0.05)，其中1 000 nmol/L的GDM作用最为明显;不同浓度的HGF+GDM组U251-MG细胞其凋亡百分率及G2/M和S期细胞百分率则显著低于相应浓度的单纯GDM组(P<0.05)(表1，图1)。

　　2.2 U87-MG细胞周期与凋亡变化 30 ng/ml HGF作用24 h后，U87-MG细胞G0/G1期缩短，而G2/M和S期延长，凋亡细胞较正常组减少(P<0.05);不同浓度的GDM单独作用U87-MG细胞，250、500、1 000 nmol/L GDM能够延长G2/M期，且促进细胞凋亡(P<0.05)，其中以500 nmol/L促凋亡能力最强;不同浓度GDM作用于与经过30 ng/ml HGF处理24 h U87-MG细胞后，能够逆转HGF抑制凋亡作用(P<0.05)(表1)。

　　2.3 U251-MG细胞增殖变化 30 ng/ml的HGF作用24 h后，U251-MG细胞增殖能力显著增强(P<0.05);单独加入不同浓度的GDM作用48 h则细胞增殖被显著抑制(P<0.05)，随浓度的增加其抑制作用逐渐增强，其中1 000 nmol/L的抑制效果最强;而不同浓度GDM联合HGF作用48 h后，U251-MG细胞增殖A值较相应浓度的GDM组显著增高(P<0.05)(表2)。

　　2.4 U87-MG细胞增殖变化 30 ng/ml的HGF作用24 h后，U87-MG细胞增殖能力较正常组显著增加(P<0.05)，单独加入不同浓度的GDM作用48 h则U87-MG细胞的增殖能力显著降低(P<0.05)，随浓度增加其抑制作用逐渐增强，其中1 000 nmol/L的作用最强;而在经过HGF作用24 h后继续应用不同浓度的GDM作用48 h，则HGF引起的细胞增殖被逆转(P<0.05)(表2)。

　　表1 各组U251-MG和U87-MG细胞在不同细胞周期细胞百分率和凋亡率变化(略)

　　与正常组比较：1)P<0.05; 与HGF组比较：2)P<0.05; 与相当浓度的GDM组比较：3)P<0.05，下表同

　　图1 各组细胞周期和凋亡流式细胞图结果(略)

　　表2 各组U251-MG 和U87-MG 细胞吸收率A值的MTT分析结果(略)

　　3 讨论

　　HGF能刺激多种类型细胞分化、增殖、运动、迁移及形态发生，是一种多功能的细胞因子。许多肿瘤均有HGF及其受体c-Met的过表达，如，胰腺癌、肺癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、甲状腺癌、淋巴瘤及多发性骨髓瘤等。

　　目前已有大量研究显示， HGF及c-Met(HGF-Met系统)在脑胶质瘤的发生发展中具有重要促进作用，提出将该系统作为治疗的新靶点。有研究证明，HGF能促进胶质瘤的生长和血管生成〔4〕。HGF及c-Met的表达水平与脑肿瘤的分级、血管密度及不良预后密切相关，是脑肿瘤生长和血管生成的关键决定因素〔5〕。Abounader等研究显示，HGF及c-Met可通过自分泌刺激环增加胶质母细胞瘤的恶性程度，而抑制HGF或c-Met表达可逆转其恶性行为〔6，7〕。总之，所有这些研究表明，HGF-Met系统作为迁移和侵袭的关键刺激因子，在脑胶质瘤的进展中具有决定性作用。近年研究证实，一种抗肿瘤抗生素GDM对HGF的抑制效力最显著，是HGF最强的抑制物，对c-Met表达也有明显下调作用，如1 nmol/L以上浓度的GDM就能完全抑制HGF介导的纤溶酶活性，fmol/L浓度即足以抑制HGF在几种肿瘤细胞引起的迁移和侵袭〔2, 3〕。GDM对HGF的强效抑制作用引起人们的高度关注，并在肝癌、肺癌、黑色素瘤等观察了GDM通过抑制HGF对肿瘤侵袭生长的抑制作用。此外，GDM是亲脂性小分子，能穿透血-脑脊液屏障，有利于颅内抗肿瘤作用的发挥。修饰后的GDM类似物毒性很低。

　　本实验以U87-MG和U251-MG人脑胶质瘤细胞作为研究对象，应用30 ng/ml的HGF作用细胞24 h后，发现其能够增强细胞增殖能力并抑制细胞凋亡;应用不同浓度的GDM(50，250，500与1 000 nmol/L)继续作用48 h后发现，GDM可以增加肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖，并且可以逆转HGF引起的肿瘤细胞凋亡抑制、细胞增殖和G0/G1期细胞百分率增高，这为脑胶质瘤的治疗提供实验证据。

　　可见GDM既能抑制HGF-Met系统，其本身还能诱导瘤细胞凋亡，是抑制胶质瘤较为理想的多功能治疗剂，它在胶质瘤治疗中的应用前景值得深入探讨。

　　【参考文献】

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　　4 Laterra J, Nam M, Rosen E, et al. Scatter factor/hepatocyte growth factor gene transfer enhances glioma growth and angiogenesis in vivo〔J〕. Lab Invest, 1997;76(4): 565-77.

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　　7 Abounader R, Lal B, Luddy C, et al. In vivo targeting of SF/HGF and c-met expression via U1 snRNA/ribozyme inhibits glioma growth and angiogenesis and promotes apoptosis〔J〕. FASEB J, 2002;16(1):108-10.