大鼠颅脑损伤后巢蛋白变化的实验研究

　　作者：邬巍 张剑涛 付双林 马程远 葛鹏飞 罗毅男 作者单位：吉林大学第一医院神经外科,吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 观察大鼠颅脑损伤后不同时期损伤周边区皮质神经细胞凋亡现象，为颅脑外伤的临床治疗提供理论依据。方法 将SD大鼠分为正常对照组(5只)和损伤组(90只)，损伤组用侧位液压冲击法制成颅脑损伤动物模型，进一步分为轻、中、重三组，采用免疫组织化学技术检测各组损伤后3、6、24、72 h、1、2 w大鼠伤灶周边皮层的巢蛋白表达情况。结果 损伤3 h后伤灶边缘皮层开始出现巢蛋白阳性细胞，随后逐渐增加，1 w达到高峰，随着时间的推移其表达逐渐下降，假手术组各时间点伤处边缘皮层也可见到少量巢蛋白阳性细胞，但低于损伤组，具有统计学意义(P<0.05)。结论 颅脑外伤可导致损伤周边区大脑皮层阳性巢蛋白神经细胞的增多，损伤后1 w为巢蛋白阳性细胞表达的高峰时间。

　　【关键词】 颅脑损伤;巢蛋白;液压冲击模型

　　基金项目：吉林省科技厅国际合作项目(20040707-1);吉林大学重大创新基金

　　巢蛋白(nestin)与颅脑损伤、修复关系的研究已成为神经外科的热点〔1〕。外伤后原发性脑损伤的主要病理改变是神经元和胶质细胞的坏死。而nestin的表达与神经系统修复关系密切〔2〕。脑损伤后脑组织可表达多种活性物质，这些物质的改变可以用来推断脑损伤经过时间〔3〕。本研究在颅脑外伤后细胞中nestin的表达变化及不同时间颅脑损伤后nestin阳性细胞比较，旨在分析nestin与颅脑损伤的关系，为颅脑损伤后不同时间nestin的表达研究提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组 SD大鼠95只，雄性，体重300～350 g，由吉林大学白求恩基础医学部实验动物中心提供。随机分为正常对照组(5只)和损伤组(90只)。损伤组按冲击时脑组织所承受力量大小分为轻(100 kPa)中(200 kPa)重(300 kPa)3个亚组，各组在损伤后3、6、24、72 h、1、2 w采集标本，重度损伤组5只大鼠在击后10 min之内死亡，未记入损伤组内。

　　1.2 模型制备 SD大鼠全麻(速眠新0.1 mg后腿肌肉注射)后置于脑立体定位仪上，沿头皮矢状缝正中切开，暴露颅骨。在正中矢状钱左侧4.0 mm，人字缝后2.0 mm处钻一直径为3 mm的小孔，保护硬脑膜完整，将液压冲击接头用牙托树脂固定在颅骨小孔，孔周围密闭，待树脂凝固后将其连至液压打击装置。以不同压力冲击左侧顶叶皮质造成液压冲击脑损伤。

　　1.3 标本采集 各组大鼠在液压冲击脑损伤后3、6、24、72 h、1、2 w，应用速眼新0.1 mg后腿肌肉注射麻醉，四肢固定于手术板上，无菌条件下，切开胸腔后暴露心脏，以穿刺针穿至左心室，并切开右心房，以0.9%肝素生理盐水灌洗，至灌流出液体清亮为止，然后以4%多聚甲醛液灌注，约5～6 min后大鼠出现四肢抖动、强直、头向后仰、似角弓反张样，迅速断头取脑。将脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h后石蜡包理，并于损伤周边区前后皮质区行连续切片(厚5 μm)后置于4℃冰箱中保存以备试验。

　　1.4 观察项目 各组每例标本取同一部位石蜡切片2张，石蜡切片常规脱蜡至水;3%H2O2灭活内源性过氧化物酶;PBS冲洗;抗原修复;PBS冲洗;正常血清封闭。一抗，4℃过夜;PBS冲洗;二抗，37℃ 30 min;PBS冲洗。DAB显色后水洗;苏木素复染，脱水、透明封片。

　　1.5 图像分析 应用IPP显微图像分析系统进行分析，置于400倍光镜下观察。在每张nestin免疫组织化学染色切片中，于损伤侧顶叶皮层取5个视野，在IPP高清晰度彩色医学图像分析系统下，测量nestin阳性细胞的平均光密度(AOD)值。采用SPSS12.0统计学软件对实验数据进行单因素方差分析。

　　1.6 统计学分析 所得数值以x±s来表示，采用SPSS12.0统计软件包分析，两组均数比较用t检验，多组均数比较在确定方差分析齐性后进行q检验。

　　2 结果

　　光镜下观察nestin阳性细胞细胞核呈棕色。轻、中、重损伤组各时间点阳性细胞数高于正常对照组(P<0.05)。轻度损伤组与中、重度损伤组比较有统计学差异(P<0.05);中度损伤组与重度损伤组比较无统计学意义(P>0.05)。损伤后3 h损伤侧顶叶皮层、海马齿状回及胼胝体区开始出现nestin阳性细胞，随后逐渐增加，1 w后nestin阳性细胞数达到高峰，之后nestin阳性细胞数逐渐下降，2 w时明显低于1 w，但高于正常水平(见表1)。

　　表1 各组不同时间颅脑损伤后nestin阳性细胞比较(略)

　　与正常对照组比较：1)P<0.05;与轻度损伤组比较：2)P<0.05

　　3 讨论

　　随着现代社会日益工业化和交通的发展，我国颅脑创伤的发生率也明显增多。颅脑受外力严重打击下，造成颅骨骨折、脑挫裂伤、颅内血肿，继而发生一系列病理变化〔4〕。损伤周边区神经细胞的恢复情况直接影响病人预后。

　　Nestin是一种胚胎时期表达的第Ⅵ类中间丝蛋白，主要存在于胚胎时期的中枢神经系统〔5〕，胚胎晚期随着干细胞的分化成熟逐渐被胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经丝蛋白(NF)等中间丝蛋白代替。正常成年哺乳动物脑内nestin阳性神经前体/干细胞仅存在于侧脑室的室管膜下区(SVZ区)和海马齿状回颗粒下层(SGZ区)〔6〕。SVZ区的神经前体细胞可像胚胎期发育阶段神经元祖细胞一样，沿着高度局限化的通道——吻侧迁移流(rostral migratory stream，RMS)迁移。即通过胼胝体或者沿着胼胝体的轴线进入嗅球，不断补充坏死的嗅神经元〔7〕。SGZ区存在的神经前体细胞能够不断增殖，并通过短距离迁移至颗粒层，分化为海马齿状回颗粒层神经元〔8〕。在机械性脑损伤、脑缺血及兴奋性毒性脑损伤等应激刺激下，神经细胞可出现胚胎期的逆转，特异性及一过性表达nestin蛋白，nestin表达明显上调，并表达于反应性星形胶质细胞，因此nestin的表达也可作为星形胶质细胞激活的敏感指标之一〔9〕，nestin的表达不仅见于损伤局部，在距损伤较远的部位，如灰质(皮质、海马、丘脑)及白质(胼胝体和内囊)也可见到〔10〕。

　　本实验初步证实了颅脑外伤后损伤区周围神经细胞存在nestin阳性细胞表达与脑损伤时间窗的相关性现象，但是关于颅脑外伤后nestin蛋白阳性神经细胞增多的发生机制及其有效的干预措施仍需进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 孙金峤，曹云涛.巢蛋白与脑损伤〔J〕.中华神经医学杂志，2005;4(4)：419-21.

　　2 贾冬梅，何光龙，周亦武，等.大鼠脑挫伤后巢蛋白表达与脑挫伤经过时间的关系〔J〕.法医学杂志，2006;22(3)：161-4.

　　3 周亦武，张益鹄，邓伟年，等.87例人脑及脑干挫伤HSP70变化的研究〔J〕.中国法医学杂志，2005;20(4)：209-12.

　　4 夏穗生，胡云龙.临床外科诊疗关键〔M〕.南宁：广西科学技术出版社，2001：503.

　　5 Lendahl U，Zimmerman LB，McKay RD.CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein〔J〕.Cell，1990;60(4):585-95.

　　6 Gould E，Reeves AJ，Graziano MS，et al.Neurogenesis in the neocortex of adult primates〔J〕.Science，1999;286(5439):548-52.

　　7 Faiz M，Acarin L，Castellano B,et al.Proliferation dynamics of germinative zone cells in the intact and excitotoxically lesioned postnatal rat brain〔J〕.BMC Neurosci，2005;6(1)：26-45.

　　8 Richardson RM，Broaddus WC，Holloway KL,et al.Heterotypic neuronal differentiation of adult subependymal zone neuronal progenitor cells transplanted to the adult hippocampus〔J〕.Mol Cell Neurosci，2005;28(4)：674-82.

　　9 Shi M，Wei LC，Cao R,et al.Enhancement of nestin protein-immunoreactivity induced by ionizing radiation in the forebrain ependymal regions of rats〔J〕.Neurosci Res，2002;44(4):475-81.

　　10 Sahin Kaya S，Mahmood A，LI Y,et al.Expression of nestin after traumatic brain injury in rat brain〔J〕.Brain Res，1999;840(1-2):153-7.