神经干细胞移植对大鼠视神经损伤后节细胞的保护作用

　　作者：柳浩然 杨长虹 高俊玮 作者单位：中南大学湘雅医院神经外科， 湖南 长沙 410008

　　【摘要】 目的 探讨神经干细胞 (NSCs) 移植对视神经受损SD大鼠视网膜节细胞 (RGCs) 的保护作用。 方法 将48只健康成年SD大鼠随机分为N组 (NSCs移植组) 和C组 (对照组)，均使用精确校准方法在右眼造成部分视神经损伤，左眼作为正常对照。从胚胎SD大鼠海马分离NSCs，利用细胞培养和体内移植技术，将培养后的NSCs注入N 组大鼠右眼玻璃体内，C组大鼠右眼玻璃体内注入同等体积的PBS，处死前3 d在双上丘注射3%快蓝逆行标记双眼RGCs。将大鼠分别于注射NSCs或PBS后7 d、14 d、21 d、28 d处死，各分为4组，每组6只，分离视网膜置于荧光显微镜下，摄影输入计算机图像分析仪计数RGC，计算RGC标识率。另取6只健康成年SD大鼠作NSCs移植，分别于移植后7 d、28 d处死，每时间段3只，通过视网膜免疫荧光切片观察NSCs在视网膜的存活、整合情况。 结果 N组大鼠各时间段RGCs标识率与C组同时间段比较均增高，有显著性差异 (P < 0.01);N组与C组RGCs标识率均随时间延长而降低，且前后段时间比较有显著性差异，但N组降低速度明显慢于C组。NSCs移植7 d后部分移植细胞迁移进入视网膜的内网层和节细胞层，28 d后可见移植细胞广泛整合至宿主视网膜内。 结论 NSCs移植入视神经损伤大鼠视网膜后可提高视网膜神经节细胞的存活率，对受损的节细胞具有一定的保护作用。

　　【关键词】 干细胞移植 视神经损伤 视网膜神经节细胞 大鼠 Sprague-Dawley

　　Protective effect of neural stem cell transplantation on retinal ganglion cells

　　of rats with optic nerve injury

　　LIU Haoran1, YANG Changhong2, GAO Junwei1, et al

　　1. Department of Neurosurgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, China; 2. Department of Neurosurgery, Hospital for Guangdong Frontier General Team, Chinese People's Armed Police Forces, Shenzhen 518029, China

　　Abstract: Objective To investigate the protective effect of neural stem cell (NSC) transplantation on retinal ganglion cells (RGCs) of Sprague-Dawley rats with optic nerve injury. Methods Forty-eight adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into group N (NSC) and group C (control). Optic nerve crush injury was induced in the right eyes by a calibrated method, and the left eyes served as the normal control. NSCs were taken from embryonic SD rat hippocampus and cultured in vitro and grafted in vivo. NSCs were injected into the vitreous body of right eyes of rats in group N. Rats in group C were injected with isovolumetric PBS. Three days before sacrifice, 3% fast blue was injected into the superior colliculi bilaterally. According to the time interval between the optic nerve crush and sacrifice, both group N and C were divided respectively into four subgroups (day 7, day 14, day 21 and day 28) with 6 rats in each one. The eyes were enucleated after the rat was sacrificed, and flat mounts of the retina from both eyes were observed under a fluorescence microscope. The labeled RGCs were counted by a computerized image analyzer. The label rate of RGCs was calculated for statistical analysis. In addition, 6 adult SD rats were treated as group N, and sacrificed on days 7 and 28 after transplantation with 3 rats each time. Survival and integration of grafted NSCs in the retina of the host animals were detected by the immunofluorescence technique. Results The label rate of RGCs in group N was significantly higher than that in group C at each time period (P<0.01). The labeled rates of RGCs in both groups N and C decreased as the time passed, but the speed of decreasing in group N was evidently slower than that in group C. Seven days after the NSCs transplantation, a few grafted cells could be seen migrating into inner retinal layer and ganglion cell layer of the host retina and on the 28th day, widespread migration of grafted NSCs could be seen into the host retina. Conclusion NSCs transplanting into the vitreous body can rescue and/or restore injured RGCs and increase survival rate of the RGCs in optic nerve-crush rat model.

　　Key words: stem cell transplantation; optic nerve injuries; retinal ganglion cells; rats, Sprague-Dawley

　　本实验取胚鼠神经干细胞 (NSCs) 体外培养后植入视神经损伤SD大鼠视网膜内，在不同时间段观察神经节细胞的变化，以探讨NSCs移植对神经节细胞修复的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 选用48只健康成年SD大鼠，月龄2～3个月，雌雄不限，体质量300～350 g。制作视神经损伤模型后，按随机数字表法分为N组 (NSCs移植组) 和C组 (对照组)，各24只，分别于注射NSCs或PBS后7 d、14 d、21 d、28 d各处死6只，作视网膜铺片及视网膜节细胞 (RGCs) 计数。另取6只SD大鼠制作视神经损伤模型后，玻璃体下腔注射定量NSCs，分别于移植后7 d、28 d各处死3只，取视网膜作免疫荧光切片。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 精确校准方法制作右眼部分视神经损伤模型： 3%戊巴比妥钠 (30 mg/kg) 腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧固定于手术台上，在双目手术显微镜下，于右侧睑缘中线处垂直剪开上睑、球结膜及部分穹窿结膜，将内直肌、上直肌钝性向后分离，暴露视神经，用头端宽1 mm的微型动脉夹在球后2~3 mm处夹持视神经6 s造成视神经损伤，此时可见瞳孔逐渐散大。分层缝合结膜及眼睑。

　　1.2.2 NSCs分离、培养： 按高俊玮等[1]报道的方法进行。

　　1.2.3 移植细胞标记： NSCs移植前48 h，培养液中加入5-溴脱氧尿核苷 (BrdU)，调整终浓度为10 μmol/L，抽样测定阳性标记率。

　　1.2.4 细胞移植： 收集标记的NSCs球，用D-Hank液洗3次后移至0.5 ml EP管内，再次离心后去上清，加入不含表皮生长因子 (EGF) 和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 的DMEM/F12基础培养液重悬细胞，调整细胞浓度为5 × 104个/μl，移植前始终置于冰上进行保护。腹腔注射戊巴比妥钠 (30 mg/kg) 麻醉N 组大鼠，在手术显微镜下，将微玻管从大鼠右侧眼球的巩膜角膜缘处插入玻璃体腔内，抽出约1.5 μl玻璃体液，随即慢慢注入等量NSCs悬液。C组大鼠采用同样方法注入等量PBS。

　　1.2.5 视网膜节细胞逆行标记： 大鼠处死前3 d，手术暴露大鼠矢状缝和人字缝，根据大鼠脑立体定位图谱确定双上丘的颅骨表面投影，在距前囟后方6.3 mm和6.8 mm处钻孔，用微量注射器将3%快蓝缓慢、均匀地注入双上丘，标记双眼并计数节细胞，剂量为每点0.5 μl，深度4.1 mm和4 mm，留针3 min后缓慢退针[2]。

　　1.2.6 视网膜铺片及RGCs计数： 大鼠处死前经心脏灌注0.1 mol/L PBS和40 g/L多聚甲醛固定，处死后分离视网膜，并于3、6、9、12点方位剪开视网膜，玻璃体一侧朝上将视网膜铺片，400倍荧光显微镜下观察，在视网膜铺片4个象限内 (颞上、颞下、鼻上、鼻下象限)，距视乳头中心1 mm、2 mm、3 mm处进行荧光拍照，将12张照片输入计算机，采用图像分析仪计数，将每只眼12处RGCs相加，计数每只大鼠的标识率，即损伤眼RGC/未损伤眼RGC × 100%。

　　1.2.7 视网膜免疫荧光切片观察NSCs在视网膜内的存活、整合与分化： 另取NSCs移植后7 d及28 d SD鼠各3只，在深度麻醉下开胸，经左心室快速灌注灭菌生理盐水40 ml冲洗血液，随即灌注0.1 mol/L PBS配制的4%多聚甲醛液200 ml，取眼球，去除角膜和晶状体，置于0.1 mol/L PBS和40 g/L多聚甲醛中固定2 h。30%蔗糖 (0.1 mol/L PBS) 过夜。矢状位切片，片厚20 μm，明胶片贴片。切片自然干燥后，进行免疫荧光标记。一抗为抗BrdU、兔抗突触囊泡膜蛋白 (synaptophysin，SYN)，二抗为Cy3标记的山羊抗小鼠IgG及FITC标记的山羊抗大鼠IgG，浓度均为1∶200。具体操作过程如下：切片用0.05 mmol/L PBS (含0.03% Triton X-100) 漂洗5 min × 3，正常山羊血清封闭30 min，一抗孵育4 ℃过夜，0.05 mol/L PBS漂洗5 min × 3，二抗37 ℃温育30 min，0.05 mol/L PBS漂洗5 min × 3，自然干燥，水溶性风片剂封片。BX50荧光显微镜下观察，图像处理软件为HMIAS-2000。

　　1.3 统计学分析 采用SPSS10.0 统计软件进行分析，样本均数采用x ± s表示，均数间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 视网膜RGCs形态观察 NSCs移植或PBS注射1周后，荧光显微镜下可见RGCs形态多样，细胞质呈蓝色，可见许多突起;NSCs移植组RGCs数目明显多于PBS组 (图1，2)。

　　2.2 RGCs计数及标识率 (表1) 由此可见视神经损伤眼RGCs计数均明显低于未损伤眼 (P <0.01);随时间的延长，两组神经节细胞标识率均呈下降趋势，组内前后时间段比较均有显著性差异 (P <0.01)，但N组下降幅度明显较C组平缓。同时间段N组RGCs标识率均高于C组，且差异具有统计学意义 (P <0.01)。

　　2.3 神经干细胞在宿主视网膜内的存活、整合 NSCs移植7 d后，在SD大鼠眼内，移植的NSCs广泛分布于RGCs表面 (图3)，视网膜横切面上，可见部分移植的NSCs迁移至视网膜的节细胞层和内网层，但外观上呈未成熟状态，BrdU免疫标记阳性。

　　NSCs移植28 d后，在所有SD大鼠视网膜内，可见NSCs广泛整合于宿主视网膜内 (图4)，大部分位于节细胞层，其突起非常丰富，伸入内网层;少部分位于内网层，靠近节细胞层或内核层，突起呈横或纵向走行，参与内网层形成;个别细胞到达内核层。

　　3 讨 论

　　本实验对大鼠NSCs移植后7、14、21及28 d分别进行RGCs计数，发现随时间延长，神经节细胞逐渐减少，但与对照组比较降低幅度明显平缓，说明NSCs移植可减缓节细胞凋亡，挽救受损但尚未溃变的细胞。项平等[3]移植骨髓间质干细胞至视神经损伤鼠视网膜内，发现干细胞移植组节细胞数量明显高于注射PBS组，与本实验观察结果类似，说明NSCs可能对节细胞存在一定保护作用。Wang等[4]在研究青光眼小鼠模型中发现：NSCs视网膜移植不能减缓受损节细胞的凋亡。Brustle等[5]认为：细胞移植后的存活、迁移、分化及生物活性与局部环境密切相关。与本研究结果存在差异，推测可能与体内微环境的差异影响了NSCs的活性有关，也可能与NSCs对损伤节细胞的修复有关，其原因仍有待进一步探讨。在RGCs生命周期中，持续的神经营养因子供应是维持其正常功能的保证。新生Wistar鼠在去除上丘或切断视神经轴突后，神经营养因子的轴浆运输被阻断，导致RGCs迅速凋亡[6]。Lu等[7]发现将NSCs移植入脊髓损伤小鼠模型中可显著促进轴突再生，检测体外培养及植入脊髓中的NSCs，发现两者均可分泌神经营养因子，包括胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、神经生长因子 (NGF) 等，因此推测NSCs是通过分泌神经营养因子促进轴突再生的，而不是直接替代损伤的脊髓。Young等[8]发现：将海马干细胞移植入视神经退行性变小鼠模型视网膜中，NSCs在移植4周时可很好地与视网膜整合，部分甚至到达外颗粒层及外膜层，但未发现NSCs可分化表达节细胞的标记物，表明NSCs不能分化为神经节细胞。已有较多研究证实：BDNF、bFGF、睫状神经营养因子 (CNTF) 等神经营养因子对神经节细胞有确切的保护作用[9~11];结合本实验结果推测：NSCs很可能通过分泌神经营养因子，间接发挥保护节细胞的作用。

　　本研究结果发现：NSCs移植7 d后，部分移植细胞迁移至视网膜的内网层和节细胞层，BrdU免疫标记呈阳性;28 d后可见移植细胞广泛整合至宿主视网膜内，但大部分移植细胞胞体位于节细胞层，少部分位于内网层及内核层，突起呈横或纵向走行，参与内网层形成，说明移植细胞向视网膜深层迁移，且可与视网膜建立结构形态上的联系。与视网膜融合的部分NSCs能表达神经元及神经胶质细胞标记物，说明移植细胞不仅能在视网膜内广泛整合，而且还能向神经元或胶质细胞样分化。Guo等[12]发现：在视网膜缺血损伤的大鼠动物模型中，玻璃体内移植的海马源性NSCs能迁移整合至受损的视网膜内，部分细胞向神经元分化。Young等[8]在视网膜退行性变的小鼠模型中发现：将NSCs行玻璃体下腔移植，可见其广泛与视网膜全层融合并分化为神经元，且部分神经元有轴突样改变。将神经干细胞球直接移植到色素性视网膜炎小鼠眼内，也可观察到NSCs在视网膜内向神经元分化[13]。推测在视神经损伤的特殊环境内，神经胶质细胞或残存的神经元可能重新分泌一些信号分子，如神经营养因子等, 并诱导其受体表达上调[14]，从而指导NSCs迁移和诱导其向神经元分化，迁移及分化后的NSCs与视网膜有着形态结构上的联系，从而为NSCs对受损节细胞的保护作用奠定了基础。

　　近年来，Wang等[4]及Lu等[7]发现：神经营养因子转基因 (如BDNF、NT-3等) NSCs在体内、外均可分泌一定的神经营养因子，有利于神经损伤的再生及神经元的修复。因此，探讨NSCs及转基因NSCs移植对视神经损伤节细胞再生的影响，将可能为视神经损伤的治疗提供崭新的策略。

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