急性局灶性脑挫裂伤对大鼠脑微循环及神经组织超微结构的影响

　　作者：王长卿 岳淑敏 陈晓峰 王洪生 薄爱华 作者单位：1.河北北方学院附属第三医院神经内科,河北 张家口 075000; 2.中国人民解放军第251医院神经外科,河北 张家口 075000; 3.河北北方学院实验中心电镜室,河北 张家口 075000

　　【摘要】目的: 探讨大鼠脑损伤后脑微循环障碍、脑缺血及神经组织超微结构的变化规律，为临床改善脑损伤后脑微循环障碍、治疗脑缺血、促进神经功能恢复提供理论依据。方法:采用Feeney's自由落体撞击法建立急性局灶性脑挫裂伤模型，共81只大鼠，随机均分为9组，每组6只行内源性过氧化物酶(EGPO)组织化学染色、脑含水量测定，并进行图象分析。每组3只电镜观察微血管内皮细胞和神经组织超微结构改变。结果:①脑损伤后30min伤区可见出血灶，伤区内无血管染色，伤区周围存在“微无血管区”。“微无血管区”的存在持续至伤后72h。②脑损伤后30min 微血管面密度明显下降，伤后48h达到高峰，直到伤后168h才有所恢复，但仍未达到正常水平。③脑损伤后30 min微血管平均光密度明显下降，伤后24h、48h回升，72h再次下降，至168h仍未恢复正常。④脑损伤后30 min，微血管内皮细胞有轻度受损迹象，伤后2h毛细血管腔内有微绒毛形成，伤后6h微绒毛增多。伤后12～72h毛细血管腔明显狭窄。⑤脑损伤后30min，神经细胞超微结构改变不明显，随时间的延长，神经细胞超微结构逐渐恶化，至伤后168h细胞结构完全丧失。结论：EGPO组织化学染色方法能准确反应脑损伤后脑微循环的改变;脑损伤后即发生脑缺血改变，神经细胞、毛细血管内皮细胞的损害继发于脑损伤后的缺血性改变，而脑缺血的发生源于脑损伤后脑微血管结构的破坏和微循环灌注的不足。

　　【关键词】 脑损伤;微循环;内源性过氧化物酶

　　The Influence of Acute Brain Regional Contusion and LaceRation of the Brain on

　　Cerebral Microcirculation and Ultrastructure of Nervous Tissue in Rats

　　WANG Changqing,YUE Shumin，CHEN Xiaofeng,et al

　　Dept. of Neurology,The Third Affiliated Hospital,

　　Hebei North University，Zhangjiakou,075000,Hebei,China

　　【ABSTRACT】 Objective:To explore the alteration law of cerebral microcirculation,the cerebral ischemia and the ultrastructure of nervous tissue after brain injury,to furnish evidence for improving the disturbance of cerebral microcirculation after brain injury and treat the cerebral ischemia.Methods:Acute regional brain trauma was obtained by Feeney's apparatus.Six cases in each group were performed endogenous peroxidase (EGPO) histochemical staining,water content of the brain and the charts were analyzed by CMIAS system.Three of them were observed on the alteration of the microangium endotheliocyte ultrastructure and nervous tissue.Results:The hemorrhage was observed at the traumatic area and the blood vessel was not stained around the traumatic area, “non” or “less” microvessels area was showed and it continued 72h.The density of microvasculature volume fraction declined at 30min.It reached peak at 48h and resumed at 168h.The MOD declined at 30min,raised again at 48h and 72h,declined again at 168h.The microangium endotheliocyte was damaged at 30min,the microvilli was formed at 2h and 6h,and the cavum of micrangium was narrowed at 1272h.The ultrastructure of nervous tissue gradually worsened after brain injury.Conclusion:EGPO histochemical staining could reflect correctly the changes of cerebral microcirculation.The brain ischemia appeared early after brain injury,which subsequently interferes with microvascular structure and hypoperfusion of microcirculation.The damage of nervous cell and microangium endotheliocyte result in the brain ischemia,which subsequently interfere microvascular structure and hypoperfusion of microcirculation.

　　【KEY WORDS】 Brain injury;Microcirculation;EGPO

　　2007年12月王长卿等：急性局灶性脑挫裂伤对大鼠脑微循环及神经组织超微结构的影响第6期2007年12月河北北方学院学报(医学版)第6期 脑外伤后引起脑微循环障碍，继而导致损伤后脑缺血改变，已得到了越来越多的研究证实。我们通过Feeneys[1]自由落体撞击法建立大鼠局灶性脑挫裂伤动物模型，应用内源性过氧化物酶(Endogenous peroxidase EGPO)组织化学染色方法显示脑损伤后脑微血管形态及微血液循环状态的改变，系统分析脑损伤后脑微血管内皮细胞超微结构改变，以探讨急性局灶性脑挫裂伤后脑微循环障碍的变化规律，为临床改善损伤后脑微循环障碍、促进神经功能恢复提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组 成年、健康Wister大鼠81只，雄性，体重200～250g，随机分为对照组和脑损伤组，后者按损伤后不同观察时相点又分为30min、2h、6h、12h、24h、48h、72h、168h组，每组9只。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 实验操作及取材 采用Feeneys自由落体撞击法致大鼠局灶性脑挫裂伤。脑损伤组用1%戊巴比妥钠按30mg/kg体重腹腔注射麻醉，右顶开颅，以750g·cm致伤力致伤;对照组开颅同损伤组，但不致伤，24h后取材。脑损伤组大鼠致伤后，按预定时相点断头处死。每组6只以损伤灶为中心冠状切开脑标本，额侧一半投入10%缓冲甲醛中固定行EGPO组织化学染色;枕侧一半行脑含水量测定。每组3只脑标本在2.5%戊二醛中固定，电镜观察微血管内皮细胞及神经细胞超微结构改变。对照组大鼠假手术后24h处死，观察指标同损伤组。

　　1.2.2 脑微循环改变观察 标本在10%缓冲甲醛中固定24h后，用半导体切片机切成60μm的冰冻切片，收集于玻璃皿中，用0.01M TBS液漂洗2次，每次5min。用DABNiCl过氧化物酶孵育液染色血管10min，自来水终止染色。用涂有铬矾明胶的洁净载玻片贴片，常规脱水、透明、封片。光学显微镜观察、摄片。应用CMIAS多功能图象分析系统检测微血管面密度(阳性目标总面积/统计场总面积)和单位面积平均光密度(Mean Optical Density，MOD)。电镜观察微血管内皮细胞超微结构。

　　1.2.3 微血管内皮细胞及神经细胞超微结构观察 动物处死后在损伤灶边缘取1mm3大小脑组织块，投入预冷的2.5%戊二醛中固定。常规丙酮梯度脱水，Epon812包埋、半薄切片、定位、修块。LKB4型超薄切片机切片，厚度40～50nm。室温下进行铅铀染色。JEM100CXⅡ型透射电镜观察、摄片。

　　1.2.4 脑组织含水量的测定 采用干湿法计算脑组织含水量。

　　1.2.5 统计学处理 数据用均数±标准差表示(x±s)。采用SPSS10.0软件进行F检验，Scheffe法进行两两比较。

　　2 结果

　　2.1 正常及损伤后脑微循环系统 应用EGPO组织化学染色，对照组大鼠脑微血管呈棕黑色，血管走行自然，无扩张，破裂及迂曲现象;血管管壁平滑，管径清晰，大小变化自然，管腔内染色深。脑损伤组伤后30min，伤区及其下方可见大面积出血灶，伤区内无血管染色;伤区周围微血管密度明显降低，且有较大面积的微无血管区。伤后2h，伤区周围微血管稀疏，染色浅淡，走行稍紊乱，存在微无血管区。伤后6h，伤区仍见大面积出血灶，伤区及出血灶内无血管染色，接近伤区的微血管断裂。伤后12h，染色微血管密度低、颜色淡，有迂曲、断裂现象，同一根血管的不同节段同时存在收缩和扩张改变。伤后24h，染色的微血管密度较低，颜色深浅不均，血管腔内同时存在深染和浅染的不同节段。伤后48h，伤区边缘大面积出血灶消失，伤区周围微血管稀疏。伤后72h，伤区边缘参差不齐，伤区下方微无血管区仍存在。伤后168h，伤区边缘有微血管形成，染色的微血管密度增加，走行较自然，颜色较深，但未恢复至正常状态。图象分析显示，伤后30min微血管面密度明显下降，伤后48h达到高峰。伤后30min微血管MOD明显下降，24h、48h回升、72h再次下降，至168h仍低于正常水平(见表1)。

　　2.2 内皮细胞超微结构改变 电镜观察对照组脑微血管内皮细胞的细胞核、线粒体、高尔基复合体、粗面内质网、滑面内质网及核糖体均清晰可见;毛细血管腔内膜光滑、连续、完整，层次清楚。脑损伤组伤后30min，毛细血管内皮细胞已有受损迹象，表现为线粒体轻度肿胀，内皮细胞内吞饮小泡增加，转运增强。伤后2h，内皮细胞线粒体肿胀成球状，毛细血管内膜不完整，有微绒毛形成。伤后6h，毛细血管腔内有大量微绒毛形成。伤后12h，毛细血管管腔明显狭窄，内膜因内皮细胞水肿而成弧形或曲线状，基底膜变薄，部分结构紊乱。伤后24h，微血管内细胞肿胀明显，细胞核轻度固缩，胞质内线粒体、粗面内质网肿胀呈空泡状;毛细血管腔狭窄，血管内膜凸凹不平，有断裂。伤后48h，内皮细胞核仁缩小，呈长条状;毛细血管腔呈缝状。伤后72h，内皮细胞核呈均质状，毛细血管内膜屈曲不平、有断裂;毛细血管腔呈缝状，血管周围水肿严重。伤后168h，毛细血管腔狭小，内膜不光滑、形状不规则;基底膜基本形成，但结构尚未完全恢复正常。表1 脑损伤后脑微血管面密度和MOD的改变注：与对照组相比*P<0.05

　　2.3 神经细胞超微结构改变 脑损伤后30min，神经细胞核仁偏离中心，染色质边集;细胞器轻度肿胀，但轮廓尚正常。伤后2h，细胞核核膜增宽，有凸起，核仁边集，染色质散在;大部分线粒体肿胀、嵴变短;细胞内散在水肿，细胞周围明显水肿。伤后6h，线粒体肿胀呈气球状，线粒体嵴减少或消失，且存在的线粒体嵴排列紊乱。伤后12h，细胞核周围有小囊泡形成，核仁浓缩，电子密度不均匀，染色质减少;胞质内线粒体呈空泡状，粗面内质网肿胀呈椭圆形，核糖体、溶酶体减少。伤后24h，细胞核形态不规则，核周有水肿带。伤后48h，核仁固缩，染色质流入基质内。伤后72h，核仁消失，胞质内可见多处散在高电子密度物质。伤后168h，整个细胞结构完全丧失。

　　2.4 伤区脑组织含水量的变化 伤后2h脑组织含水量比对照组明显增加，至48h达到最高峰。此后逐渐减退，至伤后168h与对照组比较无明显差异。

　　3 讨论

　　创伤性脑水肿是颅脑损伤后主要的继发性病理改变，而颅脑损伤后脑微循环障碍、脑缺血是引起脑水肿的主要环节[2，3]。许多研究表明，重型颅脑损伤后有“超早期”脑缺血的发生[4，5]。以往研究脑损伤后脑微循环改变多采用灌注显色剂或铸型剂的方法以使微血管显色或铸型。由于灌注剂和灌注压的原因，灌注法不仅可能刺激血管，也可能造成微血管扩张使原本已经闭塞的微血管充填显色剂或铸型剂，甚至使微血管破裂，从而不能完全真实地反应血管形态的改变;同时，显色剂或铸型剂只能显示血管的形态而不能显示活体时的血液循环状态[6]。EGPO广泛存在于红细胞、白细胞和血浆中[7]，该酶性质稳定不易被固定剂破坏、不易变性。应用EGPO组织化学染色方法显示脑组织微血管的基本原理为：EGPO与过氧化氢结合形成初级复合物，酶被还原，同时产生新生态氧使DAB氧化、聚合、环化，最后形成吲哚胺多聚体沉淀于血管腔内，将血管显示出来。脑组织血液量多，酶就丰富，反应沉积物就多，血管颜色就深。反之亦然。所以，根据血管数的多少和血管内容物染色颜色的深浅可以定量或半定量地判定活体时的血液循环[7]，并可以避免因灌注对血管造成的人为改变，保持血管的自然状态和血管径的真实大小。

　　本实验结果显示，脑损伤后30min即发生脑缺血改变，主要表现为伤区内只有出血灶染色而无血管染色，伤区周围血管稀少，失去微血管网状结构，且有大面积的“微无血管区”。电镜检查提示，微血管内皮细胞已有受损迹象。EGPO显示的伤区“无血管”、伤区周围“微无血管区”证明，此区域虽脑微血管的组织结构尚在，但微血管腔内却无血液存在。造成伤区及伤区周围微血管内血液消失的原因可能为：①自由落体直接暴力伤引起伤区血管断裂出血，断裂血管远端所供应的毛细血管床也因此而塌陷、闭塞;②小血块压迫伤区及周围微血管使之塌陷、闭塞，从而造成微血循环断流;③伤区周围脑组织水肿、肿胀压迫微血管及微血管内皮细胞肿胀。本实验还发现，伤后48h、72h脑微血管MOD升高，但微血管面密度却几近最低，此结果提示伤后48h、72h伤区及周围微血管有充血存在，但由于水肿或内皮细胞肿胀等原因尚有相当多的微血管处于闭塞状态或舒缩功能紊乱。此外，伤后30min伤区周围微无血管区面积较大，但神经细胞和微血管内皮细胞的损害还不是最严重;伤后2～72h微无血管区面积仍较大，神经细胞、微血管内皮细胞却逐渐表现出不可逆的受损改变，且神经细胞内外、微血管周围的水肿也逐渐加重;伤后168h微血管面密度有增加，微血管内皮细胞结构有改善，但神经细胞却是出固缩、坏死的改变。这些病理改变说明，神经细胞、微血管内皮细胞的损害是继发于脑缺血而发生的，而脑缺血的发生源于微血管破坏和微循环灌注不足。Maxwell等[8]在研究猫、狒狒弥漫性轴索损伤(Diffuse axonal injury，DAI)时发现，DAI后微血管内皮细胞有广泛的微绒毛(Microvilli)增多，并突向管腔。我们的研究发现，局灶性脑挫裂伤后2h微血管内皮细胞微绒毛增多，6h达高峰，但不象DAI后持续至6d。微绒毛的增多可能是内皮细胞对创伤的反应。增多的微绒毛占据微血管腔使微循环灌注减少，缺血、缺氧使内皮细胞胞浆边集，胞体肿胀，当肿胀到一定程度时则细胞破裂，使微血管内皮细胞呈火山口样缺损，继而导致BBB破坏。

　　【参考文献】

　　1 Feeney DM,Boyeson MH,Linn RT,et al.Response to cortical injury: Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211：6777

　　2 江基尧，朱诚，罗其中.现代颅脑损伤学[M].第2版.上海：第二军医大学出版社，2004.624641

　　3 于如同，高立达，官鹏，等.急性颅脑损伤脑微血管形态学改变的实验研究[J].中国微循环,2001，5(3)：203205

　　4 杨治权，马建荣，曾庆善，等.弥漫性脑损伤微血管形态学研究[J].中华神经外科杂志,2001，17(6)：382384

　　5 Schroder ML,Mrizelaar JP,Kuta AJ.Documented reversal of global ischemia immediately after removal of an acute subdural hematoma[J].J Neurosurg,1994,80(2):324327

　　6 Willner LA,Elia M,Phillips R,et al.Inadequacy of filling the capillary bed of skeletal muscle with microfil[J].Fed Proc,1987,36:523531

　　7 熊正文，李春光，李自强，等.内源性过氧化物酶染色显示微血管及判定血液循环方法的建立与应用[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1993，2(2):146147

　　8 Maxwell WL,Irvine A,Adams JH,et al.Response of cerebral microvas culature to brain injury[J].J Pathol,1998,155:327335