脑室内低温对兔脑缺血后神经细胞凋亡及P53蛋白表达的影响

　　作者：杨明飞 姚长义 李振 作者单位：中国医科大学附属第一医院神经外科，辽宁 沈阳 110001

　　【摘要】 目的 探讨脑室内低温对新西兰白兔局部脑缺血损伤后神经细胞凋亡及P53蛋白表达的影响。方法 采用线栓法制作新西兰白兔大脑中动脉闭塞(MCAO)局部脑缺血模型，缺血时间24 h。雄性新西兰白兔24只，随机分成常温组和亚低温组，2组再随机分成2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)组和凋亡组。观察动物行为、TTC 染色检测脑梗死体积、TUNEL染色观察细胞凋亡、免疫组化染色观察P53蛋白的表达水平。结果 与常温组比较，亚低温组动物肢体偏瘫程度轻、脑梗死体积小、缺血周围神经细胞凋亡少，P53蛋白表达降低。结论 亚低温神经保护机制涉及P53蛋白的表达，脑室内低温是治疗急性脑缺血的一个新方法。

　　【关键词】 脑室内低温;脑缺血;细胞凋亡;P53;新西兰白兔

　　Effects of intro-ventricle hypothermia on neurons apoptosis and P53 gene expression in rabbit model of cerebral ischemia

　　YANG Ming-Fei, YAO Chang-Yi, LI Zhen

　　Department of Neurosurgery of First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning, China

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of intro-ventricle hypothermia on neurons apoptosis and P53 gene expression in rabbit model of cerebral ischemia.Methods The rabbit model of middle cerebral artery obstruction was made by intraluminal thread approach for 24 hours. 24 New Zealand male rabbits were randomly divided into common temperature and hypothermia groups, each group being randomly divided into 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride and apoptosis subgroups to evaluate the performance of rabbits by Longa score,the infarction volume of the brain by TTC dye,the apoptosis cells by TUNEL dye and the expression level of P53 gene by immunohistochemistry.Results The animals in intro-ventricle hypothermia group had higher performance score,smaller infarction volume,fewer apoptosis cells around the ischemic core and lower P53 gene expression compared with those of normal temperature group.Conclusions The neuroprotective mechanisms of hypothermia include P53 gene expression, intro-ventricle hypothermia approach is a novel method of treating acute cerebral ischemia,which merits further investigation.

　　【Key words】 Intro-ventricle hypothermia; Cerebral ischemia; Cell apoptosis; P53; New Zealand rabbits

　　目前，缺血性脑血管病的治疗除溶栓治疗外尚无特异性方法。脑保护剂虽然应用多年，但至今仍没有一种药物能通过Ⅲ期临床研究〔1〕。许多研究已证实，亚低温作为一种非药物性脑保护疗法，对缺血损伤后脑组织具有明显的保护作用〔2，3〕。有学者认为神经细胞发生凋亡是神经细胞死亡的基本形式〔4〕。近年来的研究表明，脑缺血可引起脑神经细胞凋亡及其相关基因的表达，并认为细胞凋亡在缺血损伤中起重要作用。P53是与细胞凋亡密切相关的基因，在细胞凋亡调控过程中起重要作用。为了进一步探讨其机制，本文观察了脑室内低温对兔局部脑缺血细胞凋亡及P53蛋白表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 由中国医科大学实验动物中心提供健康雄性新西兰白兔24只，兔龄4～6个月，体重(2.9±0.3)kg。按随机数字表法分成亚低温组和常温组，各组再随机分成2，3，5-三苯基氯化四氮唑组(TTC组)和凋亡组。每组6只。

　　1.2 方法

　　1.2.1 脑缺血模型制备 对动物实行全麻，实验前动物禁食12 h，不禁水。麻醉时应用氯胺酮(7 mg/kg)和氟哌利多(0.8 mg/kg)肌肉注射。维持麻醉时采用半量肌肉注射。线栓法MCAO的制作方法参考文献〔5〕。以缺血后即刻作为零点，24 h后处死并作相应处理。

　　1.2.2 脑室低温模型制备 脑缺血模型建立后，用双腔微导管穿刺侧脑室，固定导管。导管一端为液体入口，另一端为脑室内液体流出口。等温组输入等温(38℃)等渗盐水，低温组输入冷却的20℃等渗盐水，缓慢滴注，维持出入量平衡，灌注持续2 h。

　　1.2.3 亚低温的实施与维持 维持环境温度(23±1)℃，使用DT-501红外耳式体温计连续监测新西兰白兔鼓膜温度。常温组在麻醉期间鼓膜温度维持于(38.4±1.0)℃，亚低温组鼓膜温度维持于(33±1)℃，维持2h后置于(23±1)℃室温，让其自然复温。

　　1.2.4 神经功能缺失评分 参考Longa评分法。在缺血24 h对动物进行神经功能评定，具体积分方法：0分：无神经缺陷症状;1分：不能伸展对侧前爪;2分：行走时向偏瘫侧转圈;3分：向偏瘫侧倾倒;4分：不能自发行走，意识丧失。

　　1.2.5 标本制作 缺血24 h后，过量麻醉动物，0℃生理盐水快速灌注，迅速开颅取脑，标本置-20℃冰箱冷冻15 min后做连续冠状切片，片厚3 mm ，共10片，留取第5片置4%多聚甲醛后固定以作冰冻切片用，其余厚片予TTC染色。第5片后固定72 h后，洗涤，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，常规石蜡包埋，在恒温切片机上制成厚7μm的冰冻切片，用于免疫组化。

　　1.2.6 TTC染色及脑梗死体积的测定 厚片置2%TTC磷酸缓冲液，避光，37℃恒温水浴箱孵育30 min，继以4%多聚甲醛缓冲液后固定72 h。经TTC染色的脑组织厚片，非梗死区呈红色，梗死区不着色，采用计算机图形分析系统进行梗死面积测定，梗死体积=(各片正面梗死面积之和+各片反面梗死面积之和)/2×每片厚度，换算成体积。为排除脑水肿因素干扰，以正常兔大脑体积为基准换算出梗死灶体积占大脑体积的百分比进行统计分析，以梗死体积/正常兔大脑体积×100%表示。

　　1.2.7 细胞凋亡及突变型P53蛋白的检测 细胞凋亡原位末端标记TUNEL染色采用细胞凋亡原位末端TUNEL标记试剂盒(购自武汉博士德生物技术开发公司)，细胞核呈蓝紫色染色的细胞为TUNEL染色阳性细胞。每张切片选取梗死周边区皮质随机5个不重复高倍(×400)视野，计数TUNEL染色阳性细胞平均细胞数。采用SP免疫组织化学染色法对P53进行染色，操作严格按说明书进行(相关抗体购自武汉博士德生物技术开发公司)。免疫组化染色的切片选取梗死周边区皮质随机5个不重复高倍(×400)视野，计数P53阳性细胞平均细胞数。

　　1.3 统计学处理 所有数据均以x±s表示，应用SPSS12.0统计软件进行分析，同一指标的组间比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 亚低温对兔神经病学评分的影响 亚低温组及常温组动物均有不同程度的神经功能缺损，常温组缺血24 h时平均(2.946±0.275)分，亚低温组缺血24 h时平均(1.863±0.875)分，亚低温组动物神经功能较常温组有改善(P<0.01)。

　　2.2 亚低温对脑缺血坏死区面积的影响 亚低温组梗死灶体积占全脑体积百分比均明显小于常温组(P<0.01)。常温组缺血后24h脑梗死百分比为28.35±1.02,亚低温组为15.87±0.43。

　　2.3 TUNEL染色结果 脑缺血后24 h两组均出现TUNEL染色阳性细胞，亚低温组的TUNEL染色阳性细胞数明显低于常温组(P<0.05)。常温组缺血后24 hTUNEL染色阳性细胞数为19.25±0.51,亚低温组为9.56±0.63。

　　2.4 突变型P53蛋白的表达 亚低温组P53蛋白的表达均较常温组少(P<0.01)。常温组缺血后24 hP53阳性细胞数为47.65±1.32,亚低温组为26.56±1.82。

　　3 讨论

　　江基尧等〔6〕1993年首次将28℃～35℃的轻中度低温称为亚低温，随后亚低温这一概念被国内外学者所广泛引用。许多研究已证实亚低温对缺血再灌注损伤后脑组织具有明显的保护作用〔2，3〕。亚低温作为一种重要的脑损伤保护方式，其确切的分子机制尚未清楚。目前研究发现，在脑缺血急性期，细胞坏死和细胞凋亡并存，细胞坏死主要位于缺血中心区，而细胞凋亡主要出现在缺血半暗带;再灌注后中心区凋亡减少，半暗带区细胞凋亡增多，尤以靠近中心区的半暗带边缘最明显。缺血再灌注24～48 h凋亡最严重，再灌注96 h凋亡细胞明显减少，因此可以认为，半暗带细胞凋亡是缺血性细胞死亡重要形式之一〔7〕。故寻找减少细胞死亡、抑制细胞凋亡发生、减轻局灶性脑缺血再灌注损伤的方法已成为当前脑缺血防治研究的热点〔8〕。

　　细胞凋亡又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)，是细胞按自身程序主动死亡的过程。其作用是在生长、发育过程中清除多余的细胞、发育不正常的细胞和已经完成任务的细胞以及有害的细胞，参与免疫系统细胞的发育和克隆选择等，确保正常生理过程。Shibano等〔9〕采用血清剥夺培养PC12细胞作为神经细胞凋亡模型研究发现，在37℃时发生凋亡的细胞超过90%，在33℃～35℃时神经细胞发生凋亡的百分比为42.5%，因此亚低温对神经细胞凋亡有明显抑制作用。Yashida等〔10，11〕也发现亚低温可使脑缺血凋亡细胞减少。

　　脑缺血损伤后，参与细胞凋亡的因素有很多，近年来的研究表明，P53与细胞凋亡有密切关系〔12，13〕。P53基因是一种重要的抑癌基因，是编码393个氨基酸组成的含磷蛋白质，该蛋白质位于细胞核内，相对分子量约为53KU，故而简称P53。正常的P53基因即野生型P53基因(wt- P53)与突变型P53基因(mt- P53) 均参与细胞凋亡的调节，野生型P53对凋亡有促进作用，而突变型 P53基因对细胞凋亡有抑制作用。缺血能刺激P53mRNA明显增加，导致野生型P53蛋白聚集。有实验发现野生型P53表达增加能活化其他促凋亡基因的转录，使细胞进入凋亡过程，细胞凋亡数与野生型P53基因拷贝数呈正相关〔14〕。

　　有实验发现凋亡细胞高分布区与P53蛋白表达区相近〔15〕。Maeda〔16〕等研究短暂性脑缺血后P53的表达发现，缺血区突变型P53蛋白阳性反应出现于再灌注6～96h，且与脑缺血的严重程度呈正相关，表达的细胞类型包括神经元、胶质细胞和细胞外隙，而缺血对侧则不明显。同时研究发现，野生型P53能下调Bcl-2的表达〔17〕。在脑缺血再灌注早期，内皮细胞Bcl-2表达增加抑制细胞凋亡，如未能挽救凋亡的内皮细胞，则启动P53基因表达，加速细胞的凋亡〔18〕。Colbourne等〔19〕研究证实亚低温具有抑制脑缺血损伤后海马CA1区细胞凋亡作用，提示P53快速和短暂的诱导与细胞的存活相关，显示亚低温通过P53及其相关基因在DNA的修复过程中发挥保护作用。本实验观察亚低温明显降低脑梗死体积及P53蛋白的表达。因此，可以推断出亚低温可能通过减少突变型P53蛋白的表达，进一步来减少神经细胞的凋亡，从而减少梗死体积，这可能是亚低温发挥脑保护作用的一种重要机制。

　　本研究采用脑室内低温的方法处理急性脑缺血损伤，结果表明，低温组细胞凋亡指数明显低于常温组，说明低温液侧脑室滴注可抑制急性脑缺血神经细胞凋亡，达到脑保护效果。由于脑室内低温不影响中心体温，则相应避免了全身亚低温可能发生的并发症。但此操作目前仅局限于动物实验阶段，相信随着研究的进一步深入和技术的不断完善，终将为临床治疗急性脑缺血提供有利的帮助。

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