格尔德霉素对HGF诱导的人胶质瘤细胞MMP-2及MMP-9活性的影响
发表时间：2010-07-23 浏览次数：376次
作者：王春辉 罗毅男 李蕴潜 熊文激 徐松柏 于音 作者单位：吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021
【摘要】 目的 研究格尔德霉素(geldanamycin，GDM)对肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)诱导的人胶质瘤细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2及MMP-9活性的影响。方法 应用细胞培养技术培养人恶性胶质瘤细胞系U251-MG和U87-MG，用酶谱法测定MMP-2及MMP-9活性。结果 HGF作用24 h后，U251-MG细胞中MMP-2及MMP-9活性较正常组明显增强(P<0.05);而GDM组则能够显著抑制其活性(P<0.05)，并且1 000 nmol/L的GDM对HGF诱导的肿瘤细胞MMP-2及MMP-9活性增强有明显抑制作用(P<0.05)。结论 GDM能够抑制胶质瘤细胞MMP-2及MMP-9的表达，而且对HGF诱导的人胶质瘤细胞MMP-2及MMP-9的活性增强具有明显抑制作用。
【关键词】 肝细胞生长因子(HGF);格尔德霉素;基质金属蛋白酶-2(MMP-2);基质金属蛋白酶-9(MMP-9);明胶酶谱法
Effect of GDM on MMP-2 and MMP-9 activities in glioma cells induced by HGF
WANG CHUN-Hui，LUO Yi-Nan，LI Yun-Qian,et al.
Department of Neurosurgery，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，Jilin，China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of geldanamycin (GDM) on the matrix metalloproteinases (MMP)-2 and MMP-9 activities in glioma cell induced by hepatocyte growth factor (HGF).Methods U251-MG and U87-MG of human malignant glioma cells were cultured by cell culture technique.MMP-2 and MMP-9 activities were examined by photodensity zymogram methods.Results MMP-2 and MMP-9 activities in U251-MG and U87-MG cells treated with HGF for 24 h increased significantly compared with those of normal control group (P<0.05)，while GDM inhibited this increasing tendency obviously (P<0.05).Also 1 000 nmol/L GDM significantly inhibited the increase of MMP-2 and MMP-9 activities in these two glioma cells induced by HGF(P<0.05).Conclusions GDM could inhibit the increase of MMP-2 and MMP-9 activities in U251-MG and U87-MG cells，also significantly depress their activity increase in these two glioma cells induced by HGF.
【Key words】 Hepatocyte growth factor (HGF);Geldanamycin (GDM);Matrix metalloproteinases (MMP)-2;MMP-9;Gelatinase zymogram
脑胶质瘤具有侵袭性生长行为，是临床上造成患者术后复发并致死的重要原因。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9可降解细胞外基质，为胶质瘤的侵袭和转移提供必要条件，因此在恶性肿瘤的发展中起重要作用〔1〕。而肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)通过诱导MMPs的表达来促进胶质瘤的侵袭能力〔2〕。本研究旨在研究抗肿瘤抗生素格尔德霉素(geldanamycin，GDM)对HGF诱导的人胶质瘤细胞MMP-2及MMP-9活性的影响，为临床开展胶质瘤的治疗提供新的思考。
1 材料与方法
1.1 细胞培养及药物处理 人恶性胶质瘤细胞系U251-MG和U87-MG(吉林省肿瘤研究所提供)，用含10%FBS高糖DMEM培养液培养，37℃，5%CO2饱和湿度条件下，每2～3 d消化传代1次，细胞同步生长后，用终浓度为30 ng/ml的HGF作用24 h后，加入1 000 nmol/L的GDM再处理48 h后，实验分组：正常组、细胞+HGF组、细胞+GDM组、细胞+HGF+GDM组。rhHGF (Calbiochem公司)，GDM用其衍生物17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG)。
1.2 明胶酶谱分析
1.2.1 总蛋白的提取 将按上述处理的细胞用0.01 mol/L的PBS洗3次，将培养板中的细胞刮下，转移到1.5 ml的Eppendorf 管中，1 000 r/min，离心5 min，加入1 ml细胞裂解液〔50 mmol Tris-HCl，pH8.0，150 mmol NaCl，100 μg/ml PMSF，0.02% NaN3，1 μg/ml 抑酞酶(Aprotinin)，1% Triton X-100〕，冰上放置5 min，超声裂解细胞(强度以不产生泡沫为准)。将裂解液在4℃，12 000 r/min，离心10 min，上清即为细胞总蛋白。
1.2.2 蛋白定量 采用考马斯亮蓝试剂盒(购于南京建成生物研究院)进行蛋白定量，蛋白标准品稀释成1 mg/ml，于595 nm波长处测定吸光度值，按照公式计算蛋白浓度，调整各组蛋白浓度，使其相等，分装，-70℃冻存备用。
1.2.3 酶谱法 配制10%SDS-PAGE分离胶(内含1 g/L明胶，Sigma公司产品)，上层覆盖4%浓缩胶。按照20 μl体系将样品与上样缓冲液混匀，加入到加样孔中，使用小型电泳槽(Bio-Rad mimi Ⅲ电泳系统)进行电泳，浓缩胶电压60 V，分离胶电压90 V，待溴酚蓝燃料到达底部，停止电压，取出凝胶。室温条件下，将凝胶置于25 ml/L 的Triton X-100中振荡洗脱2次，每次30 min，然后以漂洗液(50 mmol/L Tris-HCl，pH7.6)100 ml 漂洗20 min两次，接着将凝胶放入100 ml 孵育液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2)37℃中孵育24 h，用染色液(0.5%考马斯亮蓝R250、30.0%甲醇和10.0%乙酸)染色3 h，再用脱色液A、B、C (甲醇浓度分别为30.0%、20.0%、10.0%，乙酸相应为10.0%、10.0%、5.0%)分别脱色15、45 和45 min，此时即显示出MMPs 位于蓝色背景上的透明带。电泳凝胶在灰阶模式下扫描，应用BandScan 5.0 软件分析，设定参考值，MMP-2、-9活性以条带的酶解量表示，读取条带面积和酶解条带灰度，条带的酶解量=条带面积×(背景灰度-条带灰度)，每组设3个平行样。
1.3 统计学处理 各组数据以x±s表示，应用SPSS 12.0软件包进行方差分析。
2 结果
2.1 明胶酶谱分析结果 明胶酶谱法分析可见在蓝色背景下两条分子量分别为72、92 kD的溶解带(图1)。
2.2 U251-MG细胞中MMP-2、-9水平 细胞+HGF+GDM组条带面积较正常组大，较细胞+HGF组小(图1)，细胞+HGF组MMP-2、-9活性水平较正常组明显增加(P<0.05)，细胞+GDM组MMP-2活性水平较正常组稍高，而MMP-9活性水平较正常组降低，细胞+HGF+GDM组与细胞+HGF组比较MMP-2、-9活性水平明显降低(P<0.05)(表1)。
表1 各组U251-MG和U87-MG细胞中MMP-2及MMP-9活性水平(略)
1)与正常组比较，2)与细胞+HGF组比较：均P<0.05
图1 各组U251-MG和U87-MG细胞中MMP-2及MMP-9酶谱分析(略)
2.3 U87-MG细胞中MMP-2、-9水平 细胞+HGF+GDM组条带面积较正常组大，较细胞+HGF组小(图1)。细胞+HGF组MMP-2、-9活性水平较正常组明显增加(P<0.05);细胞+GDM组MMP-2、-9活性水平较正常组降低(P<0.05)，细胞+HGF+GDM组与细胞+HGF组比较MMP-2、-9活性水平明显降低(P<0.05)(表1)。
3 讨论
侵袭性生长是胶质瘤重要的生物学特点之一，也是术后复发和预后不良的主要原因。肿瘤细胞的基膜和周围的细胞外基质(ECM)是肿瘤的天然组织学屏障，其降解是肿瘤侵袭的关键环节。MMPs是一组锌离子依赖性蛋白水解酶家族，其中明胶酶MMP-2、MMP-9是ECM降解和重构的主要直接作用者，与肿瘤侵袭和转移关系最为密切。有研究证明〔3，4〕，具有明显侵袭能力的胶质瘤细胞能分泌大量MMP-2，其表达水平与侵袭力呈正相关，MMP-2是胶质瘤细胞侵袭能力的重要决定因素。HGF能刺激多种类型细胞分化、增殖、运动、迁移及形态发生，是一种多功能的细胞因子，许多肿瘤均有HGF及其受体c-Met的过表达。Yano〔5〕等用重组HGF作用于3种神经胶质瘤细胞(SNB-19、U87-MG和U373-MG)，结果发现HGF能增加细胞中MMP-2的表达，而且呈剂量依赖关系。对神经胶质瘤的免疫组化实验发现，HGF与MMP-2总是共表达于神经胶质瘤组织中，而且HGF和MMP-2的表达与胶质瘤的恶性程度密切相关，证实了HGF是通过诱导MMP-2的表达来促进神经胶质瘤的侵袭能力。HGF-Met系统作为迁移和侵袭的关键刺激因子，在脑胶质瘤的进展中具有决定性作用。近年研究证实，在已筛查的HGF抑制物中，一种抗肿瘤抗生素GDM对HGF的抑制效力最显著，是HGF最强的抑制物，对c-Met表达也有明显下调作用〔6，7〕。
本实验结果发现HGF能够使U251-MG与U87-MG细胞中MMP-2、-9活性较正常组增强(P<0.05)，而单独1 000 nmol/L GDM则能够抑制二者的活性，并且与对照组比较差异具有显著性(P<0.05)。而1 000 nmol/L GDM对由HGF引起的MMP-2、-9活性增强具有抑制作用(P<0.05)。可见GDM既可直接抑制MMP-2、-9活性，又可通过抑制HGF-Met系统，间接抑制MMP-2、-9活性，从而抑制了胶质瘤的侵袭能力，它在胶质瘤治疗中的应用前景值得深入探讨。
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