姜黄素对人脑胶质瘤SHG-44细胞抑制及凋亡的实验研究

　　作者：孙阳 赵刚 于金录 王秀华 曹静 作者单位：吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春

　　【摘要】 目的 探讨姜黄素(crucumin)对人脑胶质瘤SHG-44细胞体外抑制及凋亡调控作用。方法 20 ～ 80 μmol/L姜黄素分别处理SHG-44细胞48 h后，MTT法测定姜黄素对SHG-44细胞的细胞抑制作用及各种caspase抑制剂对姜黄素作用的影响;通过流式细胞仪Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡;透射电镜观察细胞形态学变化;荧光分光光度法检测caspase-3 活性的改变。结果 姜黄素明显抑制SHG-44细胞的增殖;诱导SHG-44细胞凋亡;caspase-3 活性增强，各种caspase 抑制剂可抑制姜黄素诱导的SHG-44细胞凋亡。结论 姜黄素可明显抑制并诱导SHG-44细胞凋亡。

　　【关键词】 姜黄素;胶质瘤;凋亡

　　近年来，对姜黄素(curcumin)抗癌作用的实验研究表明，姜黄素能抑制体内外多种肿瘤细胞的生长〔1〕，如姜黄素呈时间及浓度依赖性抑制肿瘤细胞HL-60、K562 的增殖，姜黄素也可诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡，且毒副作用小〔2〕。目前应用姜黄素对人脑胶质瘤的药理研究鲜见报道。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂 胶质瘤SHG-44瘤株购于中国科学院上海细胞研究所，常规行DMEM培养液培养;姜黄素、溴化噻唑蓝四唑(MTT，用PBS 配成2 g/L)、碘化丙啶( propidiumiodide，PI)和RNase A 购自美国Sigma 公司;DMEM 培养基、胎牛血清、胰酶均购自Gibco 公司;鼠抗人caspase-3单克隆抗体为北京中山生物技术有限公司产品。

　　1.2 仪器 酶联免疫检测仪为Bio-Rad 公司产品;流式细胞仪为Beckton-Dicknson公司产品;电镜为日立公司产品;荧光分光光度计为日立公司产品。

　　1.3 细胞系的培养与传代 人脑胶质瘤细胞株(SHG-44)采用含1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素、10%新生牛血清的DMEM 培养液，在37℃、5%CO2及饱和湿度下培养，隔天换液，待细胞长至80%～90%密度时，用0.02% EDTA 和0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2传代。

　　1.4 姜黄素贮存液的配制 以少量二甲亚砜(DMSO)助溶，加入DMEM 配制成10 mmol/L的贮存液，0.22 μm 微孔滤器过滤除菌，分装，避光-20℃保存，2 周内有效。使用时用含2%血清的DMEM培养液稀释至所需浓度，DMSO 的含量小于0.1%。

　　1.5 姜黄素对SHG-44增殖的影响 采用MTT 法检测。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×108个/L，细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μl，24 h后加无血清DMEM 培养液培养48 h，使细胞同步化于静止期。弃上清，加不同浓度姜黄素(20、40、60、80 μmol/L)，每组设5 个复孔，培养48 h，弃上清，每孔加10 μl MTT 和100 μl 无血清DMEM 培养液，继续培养4 h，去培养液，加100 μl DMSO 振荡溶解，酶标仪以测量波长570 nm 测吸光度值。抑制率(%)=[1-(药物组吸光度值/ 对照组吸光度值)]×100%。

　　1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率 不同浓度姜黄素作用(20、40、60、80 μmol/L)后，0.25% 胰酶消化，1 000 r/min离心收集细胞，PBS 液洗2遍，体积分数为80% 乙醇固定过夜。上机前离心5 min(1 000×g)去除乙醇，PBS漂洗2遍，20 g/L碘化丙啶及10 g/L核糖核酸酶37℃，避光孵育30 min后上机检测。每个样本检测10 000个细胞。

　　1.7 细胞凋亡的形态学观察 U251细胞经80 μmol/L姜黄素处理24 h 后，收集细胞用2% 戊二醛PBS 固定(4℃)，1 000×g 离心10 min，PBS 重悬细胞，吸入有琼脂空槽的离心管中，1 000×g离心10 min，切下尖槽内含细胞团的琼脂块，1% 戊二醛固定(4℃)。PBS 漂洗1 次后，1% 锇酸固定2 h。体积分数为30%、50%、70% 乙醇逐级脱水10 min。4%醋酸双氧铀快染过夜。体积分数为0.80、0.95的乙醇脱水10 min，无水乙醇脱水10 min×2次。环氧丙烷置换10 min×2 次。环氧树脂梯度渗透。618环氧树脂包埋60℃〔3〕。金刚刀超薄切片，片厚70 nm。醋酸铅片染2 min。透射电镜观察、摄片。

　　1.8 caspase-3活性的检测 按试剂盒要求进行，每6 h测定不同浓度的药物(20、40、60、80 μmol/L)作用SHG-44的A值。具体为：取1×106细胞，加入细胞裂解液100 μl，反复用吸头吹打并震荡，室温作用30 min，离心取上清液，而后加caspase-3 的底物AC-DEVD-AMC 10 μl(1 g/L)和Hepes 缓冲液900 μl，37℃水浴1 h。在360 nm 激发波长和440 nm 发散波长下用荧光分光光度计检测荧光强度，记录所得的A 值，重复3 次，取平均值作图。

　　1.9 caspase抑制剂对姜黄素诱导细胞凋亡的影响 将SHG-44细胞接种于96孔培养板中，48 h后加入caspase-3 抑制剂z-DEVD-fmk(20 μmol/L)、caspase-8 抑制剂z-IETD-fmk(20 μmol/L)、caspase-9 抑制剂z-LEHD-fmk(20 μmol/L)、caspase 家族抑制剂z-VAD-fmk(20 μmol/L)，60 min 后，各孔加入姜黄素(80 μmol/L)，设5个平行孔，于37℃，5% CO2条件下继续培养24 h后，各孔按1.5 项方法进行MTT 检测。

　　1.10 统计学处理 数据采用x±s表示，采用t检验。使用SPSS13.0统计软件。

　　2 结果

　　2.1 姜黄素对SHG-44胶质瘤细胞增殖的影响 对照组SHG-44细胞体外生长活跃，经20、40、60、80 μmol/L的姜黄素处理12、36和48 h后，SHG-44细胞生长均不同程度地减慢，并呈时间、浓度依赖性。与对照组相比，各浓度姜黄素作用48 h后SHG-44细胞生长抑制率在61.21%～88.63%之间，不同浓度姜黄素与不同时间组之间差异均有显著性(P<0.01，表1)。

　　2.2 姜黄素对细胞凋亡的影响 在20、40、60、80 μmol/L浓度出现明显的亚二倍体凋亡峰，各组的凋亡指数(%)分别是(16.12±1.72)、(32.89±2.92)、(47.55±2.76)，与对照组(6.48±0.78)% 相比，差异有显著性(P<0.05)。

　　2.3 姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的作用 HE染色光镜及电子显微镜观察可见正常细胞的细胞膜完整，光滑，细胞核正常。姜黄素处理48 h即可见具有凋亡征象的肿瘤细胞，细胞收缩变圆变小，与周围细胞失去联系，细胞核固缩深染，细胞质也收缩，随姜黄素作用时间延长，染色质广泛裂解断裂，断片沿核膜浓聚成多形性高密度区，核膜间隙增宽。

　　表1 姜黄素对SHG-44细胞的抑制率(略)

　　与对照组比较：1)P<0.01

　　图1 不同浓度姜黄素对caspase-3活性的抑制率(略)

　　2.4 姜黄素对SHG-44胶质瘤细胞caspase-3 活性的影响 20、40、60、80 μmol/L的姜黄素作用于SHG-44细胞48 h后，caspase-3 的活性随药物浓度增加呈现逐渐降低，20、40、60、80 μmol/L浓度姜黄素对其抑制率高峰值分别位于12、18、24、30 h处(图1)。

　　3 讨论

　　姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提取出来的一种酚类色素，属于天然酚类抗氧化剂〔4〕。国外研究表明，姜黄素可通过干扰正常的纺锤体的形成使肿瘤细胞不能正常的有丝分裂，从而发生G2/M期的阻滞。本研究现实姜黄素作用人脑胶质瘤SHG-44 48小时，随着黄姜素的浓度增加，G0/G1期细胞比例降低，S、G2/M期细胞比例均增高，胶质瘤细胞株SHG-44阻滞于S、G2/M期,以致细胞不能进入下一个周期。因为DNA在S期解旋、复制，大量堆积于S期，使药物作用于DNA的位点增加，易于引起基因表型的改变，从而影响细胞的代谢与功能，导致细胞重新分化Cs7。但此结果却与一般抗肿瘤药物多使细胞停留在Go/G〔5〕期不再分裂增殖的结果不一致。这表明姜黄素对不同的肿瘤细胞的分子作用靶点具有特殊性，其具体的机制尚待进一步研究。本研究结果表明，姜黄素可诱导人脑胶质瘤细胞SHG-44 凋亡，为姜黄素可能用于人脑胶质瘤治疗提供了一定的依据。

　　caspase(半胱氨酸基天冬氨酸特异性蛋白)家族成员大多数是凋亡的启动子或效应子，在细胞凋亡中发挥着重要作用。自1992年发现第一个caspase开始，迄今已经发现了14种，并依次命名。caspase-3是其中最重要的凋亡执行者之一〔6〕，在凋亡执行阶段，负责对全部或部分关键性蛋白的酶切、激活或灭活。从而使DNA断裂，成为碎片。若细胞中检出活化的caspase-3，则存在细胞凋亡。本研究中发现姜黄素对caspase-3蛋白表达有上调作用，并呈浓度依赖性，考虑是其诱导凋亡的机制之一。但是该机制的调控手段仍然需要在进一步的实验中得以阐明。

　　【参考文献】

　　1 Menon LG，Kuttan R，Kuttan G,et al.Inhibition of lung metastasis in mice induced by B16F10 melanoma cells by polyphenolic compounds〔J〕.Cancer Lett，1995;55(1-2)：221.

　　2 Zhang YJ，Xia T，Zhao YB.Effects of martin′s on the differentiation of SMMC-7721 cell line〔J〕.J Fourth Mil Med Univ(第四军医大学学报)，1998;19(3)：340-3.

　　3 舒建昌，赵景润，杨冬华，等.姜黄素对肝星状细胞增殖与凋亡的影响〔J〕.中华消化杂志，2004;24(5)：282-4.

　　4 吴丽贤，许建华，吴国华，等.姜黄素对K562 细胞增殖的影响及其与P210bcr/abl激活的Ras 信号途径的关系〔J〕.中国药理学通报，2003;19(1)：33-7.

　　5 肖培根.新编中药志〔M〕.北京：化学工业出版社，2002:574-9.

　　6 Lin CL，Zhang ZX，Xu YJ，et al.Focal adhesion kinase antisense oligodeoxynucleotides inhibit human pulmonary artery smooth muscle cells proliferation and promote human pulmonary artery smooth muscle cells apoptosis〔J〕.Chin Med J，2005;118(1)：20-6.