RNAi沉默PTTG基因对恶性胶质瘤U251细胞的影响

　　作者：徐松柏 赵红光 赵刚 许侃 于洪泉 康淑红 作者单位：吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 探讨垂体瘤转化基因(PTTG) siRNA干扰质粒对人脑胶质瘤细胞株U251体外增殖、周期和凋亡的影响。方法 利用脂质体将pGenesil-2 PTTG siRNA干扰质粒转染U251细胞，通过MTT法观察转染后24 h、48 h和72 h细胞增殖的变化、流式细胞术PI单染观察转染后48 h细胞凋亡和细胞周期的变化。结果 pGenesil-2 PTTG siRNA干扰质粒转染U251细胞48 h后，PTTG mRNA和蛋白的抑制率分别约为69%和71%;阻滞U251细胞由G1期进入S期，抑制细胞的生长，增加了细胞的凋亡。结论 PTTG siRNA表达载体可以特异高效地抑制胶质瘤U251细胞PTTG基因的表达，从而调控肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖。

　　【关键词】 垂体肿瘤转化基因;胶质瘤;细胞增殖;siRNA表达载体

　　基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(项目批准号：20070183193);吉林省科技厅课题(200505228，200705108)

　　The effect of PTTG gene silenced by RNAi on inhibition of human glioblastoma U251 cells

　　XU Song-Bai, ZHAO Hong-Guang, ZHAO Gang, et al.

　　Department of Neurosurgery, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of pituitary tumor transforming gene (PTTG) siRNA specific expression vector on U251 glioma cells proliferation, cycle and apoptosis. Methods The PTTG siRNA expression vector and empty expression vector were transfected into U251 cells by liposome 2000 to observe cell proliferation 24, 48 and 72 h later by MTT method and apoptosis 48 h after transfection and cell cycle by flow cytometry PI simple stain. Results The PTTG siRNA expression vector significantly decreased the expression levels of PTTG mRNA and protein, and the inhibition rates were 69% and 71% respectively. It also inhibited the transition from G1 phase to S phase and the growth of U251 cells and promoted apoptosis. Conclusions PTTG specific siRNA expression vector could specifically and efficiently inhibit the expression of PTTG gene to regulate cell cycle and inhibit cell proliferation in U251 glioma cells.

　　【Key words】 Pituitary tumor transforming gene (PTTG); siRNA expression vector; Glioma; Cell proliferation; siRNA expression vector

　　胶质瘤是中枢系统最常见的恶性肿瘤。手术治疗多无法根治，且对常规的化疗和放疗不敏感，临床预后差。垂体瘤转化基因( PTTG)是近年发现的一种原癌基因〔1〕，该基因在所有胶质瘤组织及其细胞系中高表达，其表达产物可以激活多种肿瘤相关基因〔2〕，抑制有丝分裂期染色体分离〔3〕，诱导血管生成〔4〕，与胶质瘤的发生、病程进展及预后密切相关〔5〕。目前，国内外尚未见以PTTG为靶点治疗脑胶质瘤的类似报道。本研究旨在探讨PTTG促胶质瘤发生发展的作用机制及靶向PTTG基因RNAi治疗对胶质瘤U251细胞PTTG蛋白表达、细胞增殖与凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人脑胶质瘤细胞株U251为本实验室传代保存，大肠杆菌DH5a为本实验室保存。转染试剂LipofectamineTM2000和ECL化学发光试剂盒分别购自美国Invitrogen和Pierce公司，RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司，小鼠抗人单克隆PTTG抗体购自Santa Cruz公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pGenesil-2 PTTG siRNA干扰质粒转染U251细胞干扰效率的测定 本实验用已构建好的针对PTTG基因的三个siRNA干扰质粒转染U251细胞。实验分为4组，分别为正常细胞对照组，Lipo2000+pGenesil-2 PTTG siRNA1组，Lipo2000+pGenesil-2 PTTG siRNA2组以及Lipo2000+pGenesil-2 PTTG siRNA3组，每组4复孔;转染48 h后收集细胞，用0.01 mmol/L PBS缓冲液漂洗3次后加入200 μl 细胞裂解液混匀、冰浴30 min。15 000 r/min离心10 min 后，以Lowry′s 法行总蛋白定量分析。制备12%分离胶、5%积层胶。按计算好的样品量上样，使各组上样量相等，在8 V/era电压条件下行SDS聚丙烯酰胺电泳，待溴酚蓝进入分离胶时，将电压提高到15 V/era。电泳结束后，将SDS分离出的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上(Millipore，USA)。以含5%脱脂奶粉的TBS溶液封闭2 h，PTTG鼠抗人单克隆一抗和β-actin室温孵育2 h，相应的二抗室温孵育1.5 h，ECL 试剂盒显色，拍照。

　　同时设计PTTG基因钓取引物，获得各组U251细胞的RNA后进行逆转录反应得到cDNA，再进行PCR扩增，检测PTTG基因在转染后的U251细胞中的表达情况。PTTG基因表达长度为363 bp，引物为：上游5′-AGTTTCAACACCACGTTTTGGC-3′;下游5′-GCTTTTCAAGCTCTCTCCTCG-3′。人内参GAPDH基因引物序列：上游：5′- GACAACTTTGGCATCGTGGA-3′;下游：5′- ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′，扩增产物长度为133 bp。

　　1.2.2 pGenesil-2 PTTG siRNA质粒对U251细胞增殖的影响 将U251细胞用无双抗的DMEM培养基铺于96孔板上，分为6组，分别为正常细胞对照组，脂质体Lipo2000组，Lipo2000+HK组(阴性对照组)，Lipo2000+pGenesil-2 PTTG siRNA1组，Lipo2000+pGenesil-2 PTTG siRNA2组以及Lipo2000+pGenesil-2 PTTG siRNA3组，每组6复孔，转染后放入37℃、5% CO2孵箱培养，于培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO振荡，并于490 nm下用酶标仪检测各孔光吸收值(A)。

　　1.2.3 pGenesil-2 PTTG siRNA质粒对U251细胞凋亡和细胞周期的影响 将U251细胞用无双抗的DMEM培养基铺于6孔板上，分组同上。转染后48 h收集细胞，1 200 r/min，离心5 min，0.01 mmol/L PBS洗两次，RNA酶消化，PI 4℃避光染色30 min，以流式细胞仪(BD，USA)检测细胞周期时相和凋亡变化。

　　1.3 统计学方法 各组数据以x±s表示，均数比较应用SPSS 14.0软件包进行方差分析。

　　2 结果

　　2.1 pGenesil-2 PTTG siRNA质粒转染U251细胞增殖的变化 与正常对照组相比，三个片段的pGenesil-2 PTTG siRNA质粒转染U251细胞后，在24、48和72 h U251 细胞增殖能力均显著降低(P<0.05或P<0.01)，且均显著低于阴性对照HK组(P<0.05或P<0.01)，以pGenesil-2 PTTG siRNA1干扰增殖效应最为明显(表1)。

　　2.2 pGenesil-2 PTTG siRNA质粒转染U251细胞周期及凋亡的变化 与正常对照组相比，转染pGenesil-2 PTTG siRNA质粒后U251细胞G0/G1期细胞及凋亡百分率显著增加(P<0.01)，而S期显著降低(P<0.01);与阴性对照HK组相比，三条片段的pGenesil-2 PTTG siRNA质粒转染U251细胞的G0/G1期细胞百分率及凋亡百分率显著增加(P<0.01)，而S期细胞百分率显著降低(P<0.01)(表2)。

　　2.3 pGenesil-2 PTTG siRNA质粒转染U251细胞干扰效率的测定 通过Western印迹法测定U251细胞中PTTG蛋白表达情况，结果可见，pGenesil-2 PTTG siRNA1、siRNA2和siRNA3转染U251细胞中PTTG蛋白表达干扰效率分别为71%、45.8%和61.3%。RT-PCR法检测发现三个干扰组PTTG mRNA水平较正常对照组分别减低69%、52%和65%(见图1、图2)。

　　表1 转染pGenesil-2 PTTG siRNA质粒后U251细胞MTT检测结果(略)

　　与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与Lipo+HK组比较：3)P<0.05，4)P<0.01;下表同

　　表2 pGenesil-2 PTTG siRNA质粒对U251细胞细胞周期和凋亡的影响(略)

　　图1 转染pGenesil-2 PTTG siRNA质粒后U251细胞PTTG表达情况(Western印迹法)(略)

　　1:DL2000 marker;2:正常对照组;3:pGenesil2-PTTG siRNA1组;4:pGenesil2-PTTG siRNA2组;5:pGenesil2-PTTG siRNA3组

　　图2 转染pGenesil-2 PTTG siRNA质粒后U251细胞PTTG mRNA电泳图(略)

　　3 讨论

　　人PTTG基因定位于5号染色体，5q33区，cDNA序列长度787 bp〔1〕。除在胚胎肝、睾丸、胸腺中高表达外，成人正常组织中PTTG均弱表达或者不表达，而在已发现的肿瘤细胞及肿瘤细胞系中却呈明显高表达〔2，3〕。研究显示，PTTG表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关〔6〕，PTTG 表达和微血管密度(MVD)、增殖细胞核抗原(PCNA)之间存在密切相关，与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小均无相关关系〔7〕，表明PTTG基因的激活可能是胶质瘤发生发展中的重要因素〔5，6〕，PTTG基因的过度表达可能促进了神经胶质细胞的增殖及恶性转化〔5〕。

　　目前认为PTTG促进胶质瘤发生发展的作用机制有3个方面：①PTTG可抑制分裂期细胞姊妹染色体的分离，使子代细胞非整倍体化，增加突变几率，促进胶质瘤表型恶化〔7〕;②PTTG蛋白中含有的PXXP序列可与多种细胞内接头蛋白的SH3域结合，通过募集多种胞内信号分子，将生长刺激信号传至核内，激活多种胶质瘤相关基因的表达，使细胞发生转化〔8，9〕;③研究显示，PTTG可上调内皮细胞生长因子(VEGF)及碱性成纤维生长因子(bFGF)，后者可诱导胶质瘤组织新生血管形成〔4〕，另外，bFGF 表达增高反过来又可增强PTTG 的表达，两者之间形成了一个自分泌/旁分泌的调节环路，促进肿瘤生长、侵袭与转移〔10〕。

　　鉴于以上PTTG与胶质瘤之间的关系，可认为PTTG是一种极具潜在价值的肿瘤治疗靶点〔11～13〕，因此通过抑制PTTG的表达，可能会有助于胶质瘤的治疗。本实验通过应用已构建PTTG siRNA干扰质粒(资料待发表)对U251细胞进行抑制，发现PTTG siRNA转染U251细胞后PTTG mRNA及蛋白表达干扰效率最高可达69%及71%，即对PTTG基因进行了高效率的沉默。MTT检测显示，转染PTTG siRNA的U251细胞增殖能力较未转染组及阴性对照组细胞显著降低，说明将PTTG基因沉默可以有效地抑制胶质瘤细胞的增殖能力。细胞周期分析显示，U251细胞转染PTTG siRNA后，G2/M期细胞所占比例明显减少，G0/G1期细胞及凋亡百分率显著增加，而S期显著降低;说明U251细胞中PTTG基因表达减少从细胞周期调控方面抑制了细胞的生长，增加了细胞的凋亡。

　　PTTG及其表达产物具有多种功能。针对PTTG的研究对明确胶质瘤的发病及转移机制以及改善胶质瘤的治疗均有重要意义〔6〕。针对PTTG的基因治疗，可能为胶质瘤的治疗提供新的策略。

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