肿瘤细胞周期中Cyclin E的失调节

　　作者：周江 姜智南 作者单位：315041 浙江省宁波市李惠利医院神经外科

　　关键词：肿瘤细胞周期中Cyclin E的失调节

　　细胞周期调控机制紊乱是细胞增生失控从而导致癌变的重要原因。Cyclin E作为CDK2的一个正向的调节亚单位，它在正常细胞的S期(S phase)有着重要的启动作用。曾经认为cyclin E的过度表达可以加速细胞周期，异常提高的细胞增殖能力而造成肿瘤发生。随着研究的深入，对于cyclin E及CDK2有了新的认识，并认为是cyclin E的失调节(Deregulation of cyclin E)导致细胞周期中染色体的不稳定性(chromosome instability，CIN)，从而造成肿瘤发生。

　　1 Cyclin E、CDK2与细胞周期

　　细胞周期(cell cycle)是指亲代细胞分裂结束到子细胞分裂结束之间的间隔时期。一个典型的细胞周期有4个期即G1-S-G2-M构成,并受到胞内外信号传导途径及反馈环路的调控。目前已发现A-J 10种细胞周期素(cyclins)作用于细胞周期,有些含亚型如cyclin D1、cyclin D2等共15种cyclins，其中cyclin E及其相关激酶CDK2是重要的G1期调节单位。

　　1.1 Cyclin E与CDK2在细胞周期中的作用

　　Cyclin E是一类核蛋白,最初是从酿酒酵母菌中提取出来的，其表达升高始于G1中期,至G1晚期的G1/S交界处达高峰,细胞进入S期后,cyclin E开始下降,到G2/M期降为零。因此cyclin E主要作用于G1晚期、S期开始之前，调控细胞从静止细胞G0期或者G1期通过限制点“R”(point of no return)进入S期。 细胞周期素依赖激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是一类蛋白激酶家族,最早发现于酵母菌中即P34cdc2。在哺乳动物中,已发现的CDKS至少达7种,分别命名为CDC2(CDK1),CDK2～7。CDK2作为其成员之一,在G1/S期转换调控中起重要作用。CDK2可与cyclin E形成功能性复合物,当复合物中的相应位点磷酸化后,该复合物才具有激酶活性。一般认为cyclin E及其激酶参与细胞周期调控的程序为:生长因子等与细胞上相应受体结合,通过信息传递促进cyclin基因首先表达,产生cyclin E等, cyclin E与CDK2结合形成复合体,促进CDK2对pRb(视网膜母细胞瘤蛋白)磷酸化;磷酸化后的pRb可释放原来与之结合的转录因子E2F;游离的E2F进入核内结合一系列具有特殊序列的基因启动区,促进这些基因的转录,细胞将通过G1→S调控点,进入自主分裂程序。

　　1.2 细胞周期中Cyclin E与CDK2的新认识

　　Cyclin E- CDK2在很长时期内被认为是细胞周期G1到S期的必要的并且是主要的调节因子。虽然Cyclin E在细胞周期的进程中仍然起着重要的作用，但是近期的试验结果给Cyclin E- CDK2的功能带来了一个新的思考：曾经被认为是不可缺失Cyclin E及CDK2在高级的真核生物发展中和真核细胞的有丝分裂中并不是必须的。试验发现在人结肠癌细胞株增殖培养中发现CDK2并不是必须因子[1]。而且，CDK2缺失的试验鼠被培育成功，并且成功生存了2年，除了不育外而无明显的病理学变化[2,3]。同时，CDK2缺失的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)在培养中除了退出静止期或进入S期的能力低于正常比率,同样体现了相对正常的增殖能力。以上这些都表明CDK2在细胞周期中的地位与以往相左，但更明确了其在细胞周期中的作用：虽然CDK2对于有丝分裂并不是必要的，而在减数分裂中却是不可少的[3]。这似乎也解释了为何CDK2缺失会使实验鼠是不育。如果，CDK2是不必要的，那么在体细胞中无所不在cyclin E是否也是可有可无的呢。虽然有证据表明从cyclin E缺失的胚胎中移出的MEFs可以在体外培养中持续增殖，但cyclin E缺失的细胞周期是否能够正常的从G1晚期进入有丝分裂过程还没有被报道。而目前对于cyclin E在静止期细胞进入细胞周期的作用却是肯定的，在cyclin E缺失的情况下，即使在其他cyclins及相关激酶处于正常水平，静止期细胞仍不能从G0进入S期[4]。可能是因为需要cyclin E来装载微染色体维持蛋白 (Minichromosome maintenance proteins, MCMs)解旋酶到染色体上，从而装配复制前体复合物(prereplication complexes)到解旋的DNA上[5]。值得注意的是，当不存在G0 到 G1 转变时，在分裂周期中cyclin E并不是装载MCM解旋酶的必须物，所以cyclin E缺失的细胞周期就有可能循序的进行。

　　2 Cyclin E失调节及与肿瘤发生的关系

　　虽然cyclin E及CDK2在细胞周期中的作用已经没有以往认为的那样举足轻重，而且曾经认为cyclin E的过度表达加速细胞周期，异常提高的细胞增殖能力而造成肿瘤发生的观点已经改变，但是cyclin E还是与多种肿瘤的发生与进展相关联。由于Cyclin E在恶性肿瘤细胞中经常存在着失调节，并且这种失调节往往与肿瘤的侵袭性和不良的预后相关[6]，目前认为其可能通过提高杂合子缺失(loss of heterozygosity，LOH)的程度而导致的CIN[7]来促进肿瘤发生。下面就Cyclin E失调节的机制以及Cyclin E失调节导致CIN的机理这两方面进行讨论。

　　2.1 Cyclin E失调节的机制

　　Cyclin E由cyclin基因表达合成，其调节主要受基因转录水平影响，而它的降解是通过泛素-蛋白酶(ubiquitin-proteasome)途径[8]。所以，除去极小一部分cyclin E基因突变的可能，它的胞内积累有可能是合成的增加，也可能是降解的减少，或者是转运机制的差错[9]。由于cyclin E的失调节通常并没有同时发生cyclin E mRNA转录的失调节[10]，这使得许多研究指向了cyclin E turnover(cyclin E转换)，把它作为Cyclin E失调节时肿瘤细胞的受损机制。cyclin E turnover是与其磷酸化相关联的，现在认为是由SCF[8](Skp1-Cull-F-box，泛素-蛋白酶)对cyclin E的泛素化起作用。这类合成酶由四个亚单位组成：(1)支架蛋白Cul1/Cdc53;(2)起催化作用的环指蛋白Roc1/Rbx1;(3)多种底物结合蛋白F-box proteins;(4) 连接F-box proteins与Cul1/Cdc53的衔接蛋白Skp1。由基因hCdc4/Fbw7编码F-box proteins可以与磷酸化的cyclin E相结合，同时，携带hCdc4/Fbw7基因的SCF复合物(SCFCdc4)可以有效的泛素化cyclin E[8,11]。试验证实hCdc4/Fbw7功能是细胞周期中cyclin E水平调节的必要条件，而hCdc4/Fbw7功能的缺失足以导致cyclin E的失调节[12，13]。由此可以得出hCdc4/Fbw7变异可能是cyclin E的失调节的重要机制。然而，hCdc4/Fbw7变异也并不必然造成肿瘤生成，就近期的实验鼠模型中的研究表明hCdc4/Fbw7可能是一种非单一有效性的肿瘤抑制基因(haploinsufficient tumour suppressor gene)[14]，这似乎可以解释为何其基因位点4q32有较高的LOH率,而无对应的高肿瘤发生率。

　　2.2 Cyclin E失调节导致CIN的机制

　　基于组织培养的试验观察指出由cyclin E介导的肿瘤抑制基因的LOH程度增加而导致的CIN可能促进肿瘤发生[7]。在动物模型中，通过促进肿瘤抑制基因位点的LOH，cyclin E的失调节能够介导肿瘤的发生。cyclin E的失调节导致CIN可以有以下几种机制：(1)由于cyclin E在G1早期的表达和有丝分裂期的持续表达干扰了复制前体复合物的装配，可以减少活性复制起点的数目，增加复制子的长度，容易导致复制叉的停顿和DNA双链的断裂,于是出现了受损的DNA复制物[15]，因为，通常为了复制前体复合物在DNA上的装配, cyclin E-CDK2激活物，在细胞周期的G1早期，需要被减量调节[16]，复制前体复合物与cyclin E-CDK2激活物的关联是确保体细胞基因组在一个细胞周期内只被复制一次的保护机制;(2)DNA复制数目的减少可以影响染色体的浓缩和姐妹染色体的内聚，因为，这些过程都是在复制叉上与DNA合成同时进行的;(3)DNA复制速率的减慢可以引起染色体的不完全复制，在细胞进入有丝分裂期时，导致染色体的不分离现象和最终形成的异常染色体组，不完全的DNA复制物可以导致染色体丢失，真核细胞的检查点机制可阻止此类突变，但由于较低的和有限的效率，此检查只起了部分的作用而导致失败;(4)cyclin E的失调节也可以直接影响进入S期的检查点机制，干扰有丝分裂，虽然cyclin E的失调节使培养细胞加速通过G1期，但却代偿性的使分裂中期向分裂后期过渡的时限延长，很大一部分这种存在有丝分裂而没有分离染色体组的细胞，导致过量的中心体和多倍体的出现，这些细胞的潜在的染色体不稳定性有助于cyclin E失调节的致肿瘤作用。以上这几种机制可能同时存在并协同作用，当cyclin E的代谢机制受损时，cyclin E的持续失调节导致CIN。

　　3 Cyclin E失调节新的研究方向

　　除了SCFCdc4在cyclin E turnover中有重要作用，其他的此类合成酶也被确认，包括c-Myc与信号域槽蛋白(signaling domains of Notch proteins)，都与肿瘤发生有关。下一步工作就是确定在hCdc4/Fbw7突变所介导的肿瘤发生过程中哪一种是关键的底物。另外， SCFCdc4的作用靶物质还不甚明了，明确与SCFCdc4有关的所有生物学底物可以帮助我们更全面的理解SCFCdc4在肿瘤发生中的作用。近期的研究表明hCdc4/Fbw7是一个非单一有效的肿瘤抑制因子，由此提出了几点论题:(1)明确SCFCdc4的作用的靶物质是今后研究的关键;(2)由于hCdc4/Fbw7功能的缺失引起cyclin E的失调节导致肿瘤发生，利用hCdc4/Fbw7作为分子标记，可以做肿瘤的早期诊断;(3)对于肿瘤的预防和治疗，利用hCdc4/Fbw7的肿瘤抑制因子特性可能可以开发特异性的提高SCFCdc4活性的药物。使用药物提高SCFCdc4的活性可能在加强cyclin E turnover方面早期预防肿瘤。

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