神经干细胞和骨髓基质细胞联合移植治疗局灶性脑缺血的实验研究

　　作者：王小林，高广中，张 勤，刘小星，蒋云召，陆 华 作者单位：(1江苏省泰州市人民医院神经外科，泰州215309;2江苏省无锡市第三人民医院神经外科)

　　【摘要】 目的：研究神经干细胞(NSCs)和骨髓基质细胞(MSCs)联合移植对脑缺血大鼠运动功能的改善效果。方法：采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型，将脑缺血大鼠随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、NSCs组及NSCs-MSCs组，分别将各组移植材料通过立体定向植入大鼠患侧纹状体内(仅标记NSCs)，术前及术后3、7、14、30 d进行神经功能缺损评分,对移植部位组织进行免疫组化染色观察。结果：30 d时NSCs-MSCs组和NSCs组有13.86%和2.81%的NSCs分化为神经元,差异有统计学意义(χ2=157.71，P<0.01),神经功能缺损评分NSCs组为1.58±0.16，NSCs-MSCs组为1.00±0.13,差异有统计学意义(P<0.05), NSCs移植后集中在移植位点及周围区域，有向缺血灶迁移的趋势。能存活、分化为神经元、星形胶质细胞，并向损伤区迁徙。结论： MSCs与NSCs联合移植可促进受损组织修复,改善脑缺血大鼠的运动功能。

　　【关键词】 神经干细胞;肩髓基质细胞;分离;培养;移植;局灶性脑缺血

　　Experimental research on the transplant therapy of NSCs- hMSCs to rat focal cerebral ischemia

　　WANG Xiaolin1, JIANG Yunzao2, LU Hua2* (1.Department of Neurosurgery, Taizhou People's Hospital, Taizhou 215309; 2..Wuxi Third People's Hospital, Wuxi 214000, *Communication Author)

　　[Abstract] Objective: To observe the improvement of motor function in the rats with focal cerebral ischemia after NSCs and MSCs co-transplantation. Method: Focal cerebral ischemia was induced by transient MCAO with a monofilament suture in adult Wistar rats. The cerebral ischemia rats were randomly divided into three groups: group PBS, group NSCs and group of NSCs-MSCs. The NSCs labled by BrdU and the NSCs marked by BrdU associated with MSCs were transplanted into rat's striatum by stereotactic operation respectively. The score standard of neural function deficient degree was used to evaluate the focal cerebral ischemia rats pre- operation and 3rd, 7th, 14th, 30th day post-operation. The tissue after transplantation was observed by immunocyto-chemistry staining. Result: The proportion of neurons differentiated from NSCs of NSCs- MSCs group and NSCs group was 13.86% and 2.81% respectively, it showed a significant difference(x2=157.71,P<0.01),The neural function score of NSCs-MSCs group at the 30th day was 1.00±0.13,while that of the NSCs group was 1.58±0.16(P<0.05). The immunocytochemistry showed NSCs might survive and migrate after transplantation. They were differentiated into neurons and astrocytes. After the 30th day of transplantation, numerous cells labeled with BrdU were present at both group NSCs and group NSCs- MSCs, which were present in the injective points and surrounding areas, and tended to migrate to the ischemia areas. Conclusion Co-transplantation of NSCs and MSCs can promote the repair of tissue and ameliorate motor function in rats with focal cerebral ischemia.

　　[Key words] NSCs; MSCs; Isolation; Culture; Transplantation; Local cerebral ischemia

　　随着人口的老龄化和生活水平的提高，脑血管疾病发病率逐年提高。脑梗死是神经系统常见病和多发病，约占全部脑卒中的70%，病死率高，大部分存活者遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来严重负担。如何改善这些患者的神经功能以及提高他们的生活质量已成为神经科学领域十分迫切而又紧要的任务。近十多年来，神经干细胞(MSCS)和骨髓基质细胞(MSCS)的发现和培养成功是医学科学领域的重大突破，它为神经发育和神经组织移植修复等研究提供了新的思路和细胞基础，具有广阔的生物学研究和临床应用前景[1-3]。我们将神经干细胞和骨髓基质细胞联合移植，探讨其改善脑缺血大鼠运动功能的效果。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验动物 选用成年健康雄性Wistar大鼠，体重250~300 g，鼠龄9~11周。购于江苏省血吸虫病防治所。

　　1.1.2 主要免疫组化试剂和仪器 BrdU﹙Sigma公司﹚、RA(Biomol公司)、鼠抗BrdU﹙Sigma公司﹚、鼠抗人Nestin IgG(BD Pharmingen)、兔抗人NSE IgG(Antibody Diagnostica Inc.)、兔抗人GFAP IgG(BioGenx公司)、羊抗兔FITC荧光二抗﹙Sigma公司﹚、SABC免疫组化试剂盒(博士德生物有限公司)、动物立体定向仪(江湾IC型)(上海第二军医大学)、微量注射器(上海医用激光仪器厂)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 脑缺血模型的制备 (1)线栓制备:将长8 cm，直径0.28 mm的尼龙线一端于酒精灯上加热成钝端，距此端19 mm处进行标记。以75%乙醇消毒后，浸入肝素液抗凝备用;(2)大鼠称重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上。常规剃毛、消毒;(3)行颈部正中切口，钝性分离胸锁乳突肌，于肌间隙内分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉及翼颚动脉，在各动脉深部穿线;(4)动脉夹夹闭颈总动脉，在颈外动脉根部略作结扎，于颈外动脉的近端侧壁剪一小口，轻插入备用栓线，遇到阻力后停止插线，深度从CCA分叉处记，约(18.5±0.5)mm;(5)阻断右侧大脑中动脉2 h后拔除尼龙线，结扎右侧颈外动脉，缝合皮肤切口。

　　1.2.2 移植前细胞准备 (1) BrdU标记NSCs：NSCs移植前接种于含Brdu终浓度为l0 μmol/L的条件培养基中孵育72 h移植。hBMSCs不予标记;(2)NSCs细胞悬液的制备:培养传代NSCs,以Brdu标记后收集第五代NSCs、反复800 r/min，离心5 min,用细胞计数板计数细胞浓度为10万/μl,以PBS液重悬细胞;(3)hBMSCs细胞悬液的制备:培养传代hBMSCs,取第五代hBMSCs用0.25%胰酶消化后,反复1000 r/min离心6 min,用细胞计数板计数细胞浓度为4万个/μl,以PBS液重悬细胞。

　　1.2.3 实验分组 采用随机数字法将大鼠随机分为3组，每组16只：对照组,不做细胞移植，注射PBS 5 μl;NSCs组,注射NSCs悬液5μl(NSCs10万/μl);hBMSCs-NSCs组,移植两种细胞混悬液5 μl(hBMSCs4万+NSCs10万/μl)。各组大鼠均于术后14 d行细胞移植。

　　1.2.4 立体定向细胞移植 将大鼠麻醉消毒后俯臥位固定头部于动物立体定向仪上，矢状切开头皮，暴露前囟。移植入纹状体的靶点坐标为：前囟前1 mm，左旁开2.5 mm，深度2 mm。取细胞悬液5 μl，移植针为连接于5 μl微量注射器的4.5号头皮针，5.5 mm深度时缓慢注射2 μl，持续5min;退出至4.5 mm时，再注射2 μl,持续5 min;再退出至2 mm时，将剩下的1μl注射结束，持续5 min，留针5 min后退出。对照组注射等量PBS。麻醉和手术期间，100 W白炽灯加热，保持动物肛温37 °C，术后置于27 °C孵育箱内至苏醒，分笼饲养。

　　1.2.5 大鼠神经功能评判标准 所有模型大鼠在细胞移植前及移植后3, 7, 14, 30 d分别进行神经功能评分。每只大鼠每个检测日在不同的时间点检测3次，取平均数记录在案。以ZealLonga 5分制为评分标准。

　　1.2.6 组织切片的制备 各组实验动物均于移植细胞后30 d时处死取脑：水合氯醛深度麻醉，快速开胸，将钝针经心尖处插入左心室至主动脉起始部，在右心耳剪一小口，灌注肝素化温生理盐水，排出血液，灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液，固定小时后，断头取脑。置于4%多聚甲醛固定24 h，冠状位切取以缺血区为中心的包括侧脑室、基底节、纹状体和海马约2 cm脑组织，经梯度酒精经脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋制成蜡块，做5 μm厚冠状切面连续石蜡切片或冰冻切片。

　　1.2.7 免疫组织化学及免疫荧光双标染色 按试剂盒的使用说明进行BrdU免疫组化染色以及BrdU/NSE、BrdU/GFAP的免疫荧光双标染色。

　　1.2.8 结果判定 对组织切片进行阳性细胞计数。每个指标随机计数3张染片，每张染片随机计数10个非重叠视野(×200)，分别计数细胞总数和阳性细胞数，计算阳性细胞比例(阳性细胞数/细胞总数)，结果用均数士标准差表示。

　　1.3 统计学方法 所得数据采用统计软件SPSS10.0进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。神经前体细胞计数,组内及组间比较均采用配对t检验;神经元计数,组间比较采用χ2检验;行为学评分采用方差分析，两两比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 移植前后大鼠神经功能行为学比较 各组移植后大鼠神经功能缺失体征评分显示：对照组只在移植后30 d时与移植前及移植后第3 d相比评分明显减低(P<0.05),而移植组在14 d、30 d时分别与各组移植前及移植后3 d时相比评分明显减低(P<0.05)。NSCs组与对照组只有在30 d时相比评分明显减低(P<0.05)。而NSCs-hBMSCs组在14 d时与对照组相比评分明显减低(P<0.05)，NSCs-hBMSCs组与NSCs组相比在30 d时评分明显减低(P<0.05),见表1。

　　2.2 病理标本

　　2.2.1 标记了BrdU的NSCs免疫组化检测 NSCs和NSCs-hBMSCs移植组大鼠脑组织切片中，纹状体、基底节区、海马针道及附近均可见BrdU染色阳性细胞分布，没有明显聚集的特征，细胞有向缺血灶方向迁移趋势，迁移的最远距离均可达2 mm。PBS对照组大鼠脑组织切片针道及附近未见BrdU染色阳性细胞(图1,2)。

　　2.2.2 BrdU/NSE、BrdU/GFAP免疫荧光双染检测

　　NSCs和NSCs-hBMSCs移植组大鼠脑组织切片中，NSCs移植组约14.3%为BrdU/GFAP双染阳性的星形胶质细胞，2.81%为BrdU/NSE双染阳性的神经元细胞;NSCs-hBMSCs移植组约13.86%为BrdU/NSE双染阳性的神经元形细胞，12.9%为BrdU/GFAP双染阳性的星形胶质细胞。NSCs-hBMSCs移植组分化为神经元的数量明显多于NSCs移植组(χ2 =157.71，P<0.01)(图3～10，表2)。

　　3 讨 论

　　对中枢神经系统的损伤或病变部位实行细胞替代治疗是最近新发展起来并极具前景的神经病学治疗策略。NSCs因取材方便，扩增迅速，具有多向分化潜能，患者可以为自身提供细胞治疗的种子细胞，避免了免疫排斥和移植物抗宿主病的发生，是理想的治疗神经系统疾病的种子细胞[4-6]。我们以往实验多单独采用NSCs或hBMSCs治疗大鼠脑缺血，但细胞植入后大多分化为神经胶质细胞，分化为有替代功能的神经元的比例非常有限，使大鼠受损的神经功能得不到明显改善。本实验采用大鼠局灶性脑缺血模型，将NSCs联合hBMSCs立体定向下植入脑缺血大鼠纹状体内，观察它们在脑缺血大鼠脑内的存活、迁移、分化情况以及大鼠神经功能障碍的恢复状况，探讨NSCs和hBMSCs联合移植治疗局灶性脑缺血的可行性、移植的安全性、移植时机、移植后神经细胞的存活以及在神经功能恢复方面的作用和机制，并进一步探索hBMSCs在NSCs移植后如何发挥影响，以期为临床上NSCs和hBMSCs联合移植治疗脑卒中提供理论依据。

　　我们实验显示将NSCs和hBMSCs通过立体定向联合植入脑缺血大鼠脑内，大鼠的神经损伤严重缺失评分等功能检测优于NSC组和对照组;联合移植组和NSCs组相比，联合移植组的神经损伤严重缺失评分、水迷宫试验恢复早于NSCs移植组。我们分析可能是NSCs移植后大部分分化为神经胶质细胞，推测是由于梗死灶中含有大量析出的血清成份诱导分化所致[7]。体外血清诱导分化实验表明,血清比例越高,分化的胶质细胞越多。因此,NSCs分化与所处环境有关。此外，有资料表明,在神经元发育过程中,MAP-2的表达开始于较为成熟的神经元[8],提示那些具有典型神经元形态但MAP-2染色阴性的细胞可能为不成熟的神经元,而在骨髓间充质细胞提供的环境下,神经干细胞的后代中成熟神经元所占的比例可能将会更高。也有研究发现,移植后的NSCs分化结果与宿主临近区域的细胞相类似[9-10]。而将NSCs联合hBMSCs移植后,NSCs分化为神经元的数量明显增多,这提示在大脑组织中hBMSCs对NSCs的增殖、分化有促进作用,在hBMSCs的作用下,NSCs分化成的神经元更多。因此，联合移植组大鼠神经功能改善情况优于对照组可能因有：(1)hBMSCs在移植部位会通过分泌多种生长因子和细胞外基质,以及改变NSCs的分裂、分化和迁徙等方式,改变移植局部的微环境,为NSCs向神经元分化和神经组织的再生提供有利条件;(2)已有体外实验证实hBMSCs具有诱导NSCs分化为神经元样细胞的作用，将NSCs-hBMSCs移植至大鼠的纹状体，宿主的神经元和由移植的NSCs分化成的神经元之间亦可能形成功能性突触联系，移植细胞表达一些神经递质受体，与宿主细胞起到相互营养作用[11];(3)植入细胞替代损伤或坏死的神经组织而重建神经通路，也可能是其发挥治疗作用的机制之一。

　　尽管近年来有关NSCs和hBMSCs的分离、培养和神经分化潜能及脑缺血性疾病应用方面的研究很多, 并取得了较大的进展, 但NSCs联合hBMSCs移植治疗脑缺血性疾病还存在很多问题有待解决: (1)如何提高NSCs向特异性神经细胞定向分化的能力;(2)NSCs和hBMSCs联合移植的时机,移植途径, 移植细胞数量尚需进一步实验研究;(3)移植的免疫排斥反应、安全性问题有待深入研究;(4)NSCs-hBMSCs移植后改善宿主缺血性脑损伤功能的机制尚不明确;(5)植入细胞如何与宿主细胞整合、由其分化而来的表达神经组织标志的细胞是否具有正常神经细胞的功能、hBMSCs如何对NSCs发挥影响、能否同其他神经细胞建立联系以及重建神经环路等仍有待进一步研究。

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