定向基因传递载体pET15bZVP1的构建

　　作者：折潇，屈秋民，翟海燕 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院神经内科，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 在JCV VP1氨基末端插入SPA的IgG结合区(Z区)，构建原核表达质粒pET15bZVP1。方法 PCR扩增JCV基因组VP1和SPA基因的Z片段;重组PCR连接Z片段和VP1;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切将ZVP1片段插入原核表达质粒pET15b。结果 经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳纯化，分别得到VP1和Z片段;再用重组PCR将Z片段和VP1连接成ZVP1重组基因;双酶切将ZVP1插入pET15b的BamHⅠ和NcoⅠ两个酶切位点之间，并经酶切鉴定和DNA测序证实。Western blotting证明pET15bZVP1在体外表达重组蛋白VP1Z。结论 成功在VP1氨基末端插入Z区，构建了原核表达质粒pET15bZVP1，并体外表达重组蛋白VP1Z。

　　【关键词】 基因治疗;定向基因传递;JC病毒

　　Construction of pET15bZVP1 vector for targeting gene deliveryZHE Xiao, QU Qiumin, ZHAI Haiyan

　　(Department of Neurology, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT:Objective To construct the vector pET15bZVP1 by inserting the Z fragment into aminoterminal of JCV VP1. Methods The VP1 and Z fragment were amplified by PCR from plasmid pET15b and pEZZ18 respectively, and then they were linked by recombinant PCR. The ZVP1 fragment was inserted into plasmid pET15b by restriction enzyme BamHⅠ and NcoⅠ. Results The VP1 and Z fragment were obtained by PCR and gel purification. The ZVP1 fragment, which was linked by recombinant PCR from VP1 and Z fragment, was inserted into plasmid pET15b between BamHⅠ and NcoⅠ sites, and confirmed by enzyme digestion and DNA sequencing. The expression of VP1Z was confirmed by Western blotting. Conclusion The plasmid pET15bZVP1 has been constructed successfully by inserting Z fragment into aminoterminal of VP1.

　　KEY WORDS: gene therapy; targeted gene delivery; JC virus

　　随着人口老龄化的迅速发展，许多中枢神经系统疾病将会严重威胁人们的健康。对于这些疾病至今仍缺少有效的治疗方法，基因治疗被认为是最有希望的方法之一，而制约基因治疗的核心是缺少理想的基因载体[1]。JC病毒(JCV)是一种嗜神经病毒，其主要外壳蛋白VP1在体外可自我组装成病毒样颗粒(VLP)[2]。研究证明[3]VLP具有与完整病毒相同的受体结合、胞吞转运等生物活性。在体外，VLP可经二硫苏糖醇(DTT)和EGTA裂解为VP1单体;含钙离子溶液透析时，VP1又可重新组装成VLP，并包裹外源性DNA[4]。因此，VLP具有基因载体的基本特性。

　　由于JCV受体广泛分布于多种组织来源的细胞表面[5]，因此，VLP作为基因载体缺乏组织细胞特异性。如能使其具有靶向性，特异性结合到靶细胞，则VLP有望成为一个理想的中枢神经系统基因载体。研究表明[67]，从金黄色葡萄球菌细胞膜提纯的蛋白质A(SPA)，能与IgG抗体Fc端结合，将SPA的IgG结合区(Z区)插入某一蛋白质，该蛋白质即具有IgG结合功能。体外限制性蛋白水解分析发现，JCVVP1氨基末端暴露于VLP表面，对VLP颗粒形状维持并非必需，体外修饰并不影响VLP的生物特性[4]。如果将SPA的Z区插入VP1氨基末端，体外重组病毒样颗粒(VLPZ)，不仅保持VLP原有的生物特性，同时也具有IgG结合功能。借助特异性抗体，VLPZ可特异性结合到靶细胞，实现治疗基因的定向传递。为此，本研究在JCV VP1氨基末端插入SPA Z区，构建原核表达质粒pET15bZVP1。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 质粒pET15bVP1由北海道大学医学部分子细胞病理研究室澤洋文教授惠赠， VP1片段全长1065bp。质粒pEZZ18购自Pharmacia Biotech公司，包含两个重复的Z片段，每个Z片段全长174bp。质粒pET15b购自Novagen公司，为含T7启动子的表达质粒，氨苄青霉素抗性，全长5708bp。

　　1.2 方法

　　1.2.1 扩增VP1片段 上游引物VP15′GCTCAGGCGCCGAAAATGGCCCCAACAAAAAG;下游引物VP13′GACAGGATCCTTACAGCATTTTTGTCTGCAAC。下游引物中引入BamHⅠ酶切位点，加下划线表示，扩增基因片段长1065bp。

　　用2μL质粒pET15bVP1为模板，PCR试剂盒进行扩增。PCR反应条件为：预变性95℃ 2min 30s，变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 1min 20s，共20个循环;72℃延伸5min，终止反应。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照TIANGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收目的DNA(VP1片段)。

　　1.2.2 扩增Z片段 上游引物Z5′CTGCGCAACACGATGCCATGGTAGACAACAAA，下游引物Z3′ CTTTTTGTTGGGGCCATTTTCGGCGCCTGAGC。上游引物中引入NcoⅠ酶切位点，加下划线表示，扩增基因片段长174bp。

　　用2μL质粒pEZZ18为模板，PCR试剂盒进行扩增。PCR反应条件为：预变性95℃ 2min 30s，变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 30s，共20个循环;72℃延伸5min，终止反应。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照TIANGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收目的DNA(Z片段)。

　　1.2.3 双重PCR连接Z片段和VP1片段 以胶回收的2μL Z片段和2μL VP1片段为模板，分别以Z5′和VP13′为上、下游引物，建立PCR反应体系。PCR反应条件为：预变性95℃ 2min 30s;变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 1min 20s，共20个循环;72℃延伸5min，终止反应。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照TIANGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书，回收目的DNA(ZVP1片段)。

　　1.2.4 将ZVP1插入pET15b 连接的ZVP1片段和质粒pET15b分别用BamHⅠ和NcoⅠ进行双酶切，酶切产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的DNA。胶回收的ZVP1片段和质粒pET15b应用T4DNA连接酶连接，4℃过夜，胶纯化连接产物。

　　1.2.5 连接产物的鉴定 重组质粒pET15bZVP1以BamHⅠ和NcoⅠ双酶切，20g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察，进行双酶切鉴定;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切鉴定筛选出的阳性克隆质粒交给生物公司，使用T7和T7ter测序。

　　1.2.6 VP1Z的表达和纯化 应用热激发将重组质粒pET15bZVP1转化进入感受态细胞BL21(DE3)/plys，次日挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基上37℃过夜培养。以1∶100的比例转接菌液，37℃继续培养3h，加入终浓度1mmol/L的IPTG，30℃继续振荡培养4h，以诱导VP1Z的表达。离心集菌后，以结合缓冲液重新悬浮，加入溶菌酶冰上反应30min，超声破碎细胞，离心收集上清。参照VLP的制备方法[4]制备VLPZ。

　　2 结 果

　　2.1 制备VP1 以pET15bVP1为模板，PCR扩增VP1片段。PCR产物进行凝胶电泳，显示扩增产物为单一条带，与VP1长度(1064bp)接近，证明成功扩增了VP1片段(图1)。胶回收VP1片段。

　　图1 胶回收的VP1片段

　　Fig.1 Purified VP1 fragment

　　2.2 制备Z片段 以pEZZ18为模板，PCR扩增Z片段。取PCR扩增产物进行凝胶电泳，显示扩增产物为单一条带，与Z长度(174bp)接近，证明成功扩增了Z片段(图2)。胶回收Z片段。

　　图2 胶回收的Z片段

　　Fig.2 Purified Z fragment

　　2.3 连接ZVP1片段 取胶回收的VP1片段和Z片段进行双重PCR。凝胶电泳显示PCR扩增产物为单一条带，片段长度与ZVP1(1239bp)接近，证明成功将Z片段和VP1连接成ZVP1(图3)。胶回收ZVP1片段。

　　图3 胶回收的VP1Z片段

　　Fig.3 Purified VP1Z fragment

　　2.4 构建pET15bZVP1 为了将ZVP1片段插入质粒pET15b中，取质粒pET15b和ZVP1分别用BamHⅠ和NcoⅠ进行双酶切，酶切产物应用DNA连接酶连接，反应产物进行凝胶电泳，显示连接产物为单一条带，证明成功将ZVP1片段插入到质粒pET15b中(图4)。

　　图4 构建的质粒pET15bZVP1

　　Fig.4 Plasmid pET15b ZVP1

　　2.5 pET15bZVP1的酶切鉴定 为了证明ZVP1插入原核表达质粒pET15b，取制备的重组质粒pET15bZVP1进行BamHⅠ和NcoⅠ双酶切，酶切产物进行凝胶电泳，结果显示：酶切产生了1239bp和5000bp两个片段，分别与ZVP1和质粒pET15b位置相同，证明ZVP1成功插入到质粒pET15b中(图5)。

　　2.6 PET15bZVP1的测序鉴定 为了进一步证实ZVP1插入到质粒pET15b的BamHⅠ和NcoⅠ两个酶切位点之间，将提取的重组质粒pET15bZVP1送上海生工测序鉴定。前向测序从40bp开始，CCATGG为NcoⅠ酶切位点，后接Z、VP1序列;后向测序，从24bp开始，GGATCC为BamHⅠ酶切位点,后接VP1序列，证实ZVP1片段成功插入pET15b。

　　图5 pET15bZVP1双酶切电泳

　　Fig.5 Identification of pET15bZVP1 by digestion with restriction enzyme

　　1：标准核酸分子质量;2：质粒PET15b;3：ZVP1片段;4：质粒PET15bZVP1经BamHⅠ、NcoⅠ酶切后的产物。

　　2.7 VP1Z的表达和纯化 VP1大小约42～45ku，在VP1氨基末端插入PAZ区为174bp，故重组的VP1Z约为50ku。取重组蛋白进行SDSPAGE电泳和Western blotting，结果显示pET15bZVP1转染菌经IPTG诱导后出现50ku目的条带，与预期的VP1Z蛋白分子质量大小相符(图6)。

　　3 讨 论

　　为了使VLP能特异性结合到靶细胞，本研究利用蛋白质A能与IgG抗体Fc端结合的特性，将SPA的IgG结合区Z区插入VP1的氨基末端，体外表达VP1Z。使体外重组的VLPZ既有抗体结合功能，又保持VLP原有的受体结合、胞吞、转运等特性。为此，本研究首先以pET15bVP1、pEZZ18为模板，分别扩增VP1、Z片段，应用重组PCR技术构建ZVP1。然后通过限制性内切酶BamHⅠ和NcoⅠ双酶切，将ZVP1片段插入质粒pET15b，成功构建了原核表达质粒pET15bZVP1，并经酶切鉴定和DNA测序，证实ZVP1插入到原核表达质粒pET15b的BamHⅠ和NcoⅠ两个酶切位点之间，并在体外成功表达了重组蛋白VP1Z。

　　为了将VP1与Z片段连接成VP1Z片段，本研究选择了重组PCR。该技术是一种用于体外基因重组的简单、高效、快速技术，在基因重组过程中，不受载体和待连接DNA片段内部自身酶切位点的制约，连接时不依赖于限制性内切酶和连接酶，从根本上摆脱DNA片段内部酶切位点的束缚，具有传统的DNA重组技术无法比拟的优势[8]。其中重叠延伸拼接(splicing by overlap extension, SOE)通过重叠延伸引物(上游片段的3端碱基序列和下游片段5端碱基序列的共线化形式)人为地在不同的靶基因片段上引入重叠互补区，引导这些片段顺序连接。主要用于制备嵌合分子或完整cDNA、框内删除和插入片段以及定点突变[8]。因此，本研究选择SOE技术，成功将VP1与Z片段连接在一起，构建了ZVP1片段。

　　pET15b是常用的原核表达质粒，不仅具有拷贝数高、分子质量小、带有筛选标记、具有较多单一限制性酶切位点及转录终止子等优点，而且Novagen公司的pET系统使用T7启动子。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制，基因表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导，不仅十分有效，而且具有选择性。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。诱导表达后数小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，还可避免目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性造成的质粒不稳定[9]。在我们以前的研究中，已经利用质粒载体在体外成功表达了VP1基因片段，制备了VLP[4]，并证明VLP以完整的颗粒形式包裹外源基因进入细胞核[10]。因此，本研究选择质粒pET15b作为基因载体。

　　pET翻译载体在克隆和标签区域后以3种阅读框形式提供翻译终止密码子以及下游T7 转录终止子。终止子对于大多数蛋白的高效表达并非必要，但对于一些方向与目的基因一致的氨苄抗性基因(β内酰胺酶)的pET质粒情况就不同了。如果T7转录终止子在克隆时被去掉，就会随目的蛋白表达增加，T7RNA聚合酶造成高效通读转录。几乎所有pET载体都能表达不带载体编码序列的蛋白。许多载体提供一个NdeⅠ或NcoⅠ位点，以便在插入编码序列5′端克隆进AUG起始密码子。与此类似，在插入片段中带上翻译终止密码子，就可以避免在蛋白的C端带有载体编码序列。在pET载体中，NcoⅠ位点(CCATGG)中的ATG三联密码子编码T7RNA聚合酶转录产物N端甲硫氨酸AUG起始密码子。因此，本研究将ZVP1插入NcoⅠ位点。

　　本研究成功在JCV VP1氨基末端插入SPA的Z区，构建了原核表达质粒pET15bZVP1，并在体外表达VP1Z，但是表达的VP1Z能否重组成病毒样颗粒(VLPZ)，重组的VLPZ是否具有与野生型VLP相同的生物活性，是否具有抗体结合特性，均有待于进一步研究。

　　致谢：感谢北海道大学医学部分子细胞病理研究室澤洋文教授惠赠质粒pET15bVP1。

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