β1，4-GalT I在大鼠坐骨神经损伤后脊髓和背根神经节中的表达

　　作者：陈伉丽　严美娟，　张英 作者单位：1复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系，　上海 200032;　2南通大学江苏省神经再生重点实验室

　　【摘要】 目的：观察β1，4-GalT I mRNA在坐骨神经损伤后相应节段脊髓和背根神经节中的表达变化。方法：采用real-time PCR 方法， 分析β1，4-GalT I mRNA在大鼠坐骨神经损伤后相应脊髓和背根神经节中的表达变化。运用原位杂交检测β1，4-GalT I在脊髓和背根神经节中的定位情况。结果: Real-time PCR 显示，与正常脊髓和背根神经节相比， β1，4-GalT I在坐骨神经损伤后发生表达变化。原位杂交结果显示β1，4-GalT I在正常脊髓中的表达较弱，主要表达于脊髓灰质中，而损伤后在灰质和白质中均可见有大量的阳性信号。β1，4-GalT I在背根神经节中则主要定位于神经元。结论: 本实验发现β1，4-GalT I在正常脊髓和背根神经节中有表达， 并在坐骨神经损伤后发生表达变化。提示β1，4-GalT I在周围神经损伤后再生和退变过程中可能发挥一定的作用。

　　【关键词】 坐骨神经损伤;β1，4-GalT I;实时定量聚合酶链反应;原位杂交;脊髓;背根神经节;大鼠

　　Expression of β1,4-GalT I in rat spinal cord and dorsal root ganglion after sciatic nerve injury

　　1CHEN Kangli， 2YAN Meijuan， 1ZHANG Ying (1Department of Biochemistry and Molecular Biology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai， 200032; 2Jiangsu Key Laboratory of Neuroregeneration， Nantong University)

　　[Abstract] Objective: To observe the expressive changes of β1，4-GalT I mRNA in corresponding spinal cord and dorsal root ganglion after sciatic nerve injury. Methods: Real-time PCR was used to detect the expressive changes of β1，4-GalT I mRNA in corresponding spinal cord and dorsal root ganglion after sciatic nerve injury. The localization of β1，4-GalT I mRNA in corresponding spinal cord and dorsal root ganglion was explored by using in situ hybridization. Results: Real-time PCR revealed that， compared with the normal control group， the expressive levels varied after sciatic nerve injury. In situ hybridization showed that the expression of β1，4-GalT I in normal spinal cord was weak and mainly located in the grey matter of spinal cord， and the expression signals were enhanced in spinal cord after sciatic nerve injury and distributed in the grey and the white matter. β1，4-GalT I mainly located in neurons in dorsal root ganglion. Conclusion: β1，4-GalT I is present in normal spinal cord and dorsal root ganglion， and it varies after sciatic nerve injury. These results indicate that β1，4-GalT I may play roles in peripheral nerve regeneration and degeneration after nerve injury.

　　[Key words] Sciatic nerve injury;β1，4-GalT I;Real-time polymerase chain reactin; In situ hybridization;Spinal cord;Dorsal root ganglion;Rat

　　机体中具有重要生理和病理作用的糖复合物是指含糖链的生物大分子，包括糖蛋白、糖脂、蛋白多糖和杂多糖等。糖基转移酶主要存在于内质网和高尔基体中，将翻译的蛋白质加工成成熟的糖蛋白。半乳糖基转移酶属于糖基转移酶这一大家族中的一个亚类，它们都以UDP-半乳糖苷为糖基供体。β-1，4-GalT I是最早被克隆的一种糖基转移酶，为单链跨膜Ⅱ型膜糖蛋白[1]。除在高尔基体合成糖苷键的功能外，还表达在细胞膜上，通过结合毗邻细胞质膜上或细胞间质中的糖复合物末端的N-乙酰氨基葡萄糖或半乳糖基而发挥细胞黏附作用[2]。已有研究发现，β-1，4-GalT I在损伤后坐骨神经中发生表达变化，主要表达于施万细胞中[3-4]，但对坐骨神经损伤后相应节段脊髓及背根神经节中β1，4-GalT I的研究尚未见有报道。本课题主要观察β1，4-GalT I mRNA坐骨神经损伤后相应节段脊髓和背根神经节中的表达变化，进一步探讨β1，4-GalT I在坐骨神经损伤过程中的作用。

　　1　材料和方法

　　1.1 实验动物 成年体质量200～220 g 的SD 大鼠，雌雄不拘， 由复旦大学实验动物中心提供。

　　1.2 模型制备 SD 成年大鼠共48 只，随机分为8 组，即正常对照组及坐骨神经损伤后6 h 、12 h 、1 d、2 d、1 w、2 w、4 w，每组6 只。根据文献[5]的方法，对损伤组大鼠行单侧坐骨神经夹伤术或坐骨神经横断术。主要过程为： 将SD大鼠随机分8组，每组12只，复合麻醉剂(xylazine， 10 mg/kg; ketamine， 95 mg/kg; acepromazine， 0.7 mg/kg)腹腔注射麻醉。每只大鼠均以左侧坐骨神经为正常对照侧，右侧坐骨神经为手术侧。手术时，暴露大鼠双侧坐骨神经，左侧进行假手术，右侧在距梨状肌下孔0.5 cm处切断坐骨神经，远侧端截除0.5 cm神经端。实验大鼠手术后分别存活6 h、12 h、1 d、2 d、1 w、2 w、4 w，在麻醉下分别取大鼠坐骨神经相应节段脊髓和背根神经节进行实验。

　　1.3　　　总RNA的提取 将不同实验分组大鼠腹腔麻醉，严格无菌操作，各实验组均取坐骨神经相应节段脊髓组织和背根神经节。采用Invitrogen 公司的Trizol 试剂盒， 按说明书操作， 提取脊髓和背根神经节组织中的总RNA，溶解于1 ml Trizol 中，-80 ℃保存。以电泳和波长260 nm 光谱吸收的情况来判断所抽提RNA的质量和浓度。

　　1.4　　　cDNA合成 采用Fermentas 公司的逆转录试剂盒， 按说明书操作， 合成cDNA。

　　1.5　　　Real time-PCR 以上述cDNA 为摸板进行实时荧光定量PCR 检测。以β2-M基因的表达作为内参。β1，4-GalT I和β2-M引物和探针序列详见表1。

　　数据处理方法：以同一份标本β1，4-GalT I拷贝数/β2-M 拷贝数表示β1，4-GalT I 基因的表达水平， 并以此值作图。3 次独立实验， 每次实验重复3 次。

　　1.6　　　取材与切片 用复合麻醉剂(5 ml/kg) 腹腔麻醉经心灌注固定。取坐骨神经相应节段脊髓和背根神经节浸于 4%多聚甲醛中，外固定时间不超过6 h，20%蔗糖、30%蔗糖依次梯度脱水。OCT包埋，连续切片，切片厚度10 μm。

　　1.7　　　原位杂交 组织切片43 ℃烤片过夜，DEPC 水洗，0.2 mol/L HCl、0.3%Triton X-100、0.2%甘氨酸/PBS 作用， 蛋白酶K(1 μg/m1) 37 ℃消化25 min。0.2%甘氨酸/PBS、PBS 孵育。4%多聚甲醛室温固定;PBS、乙酸酐/ 三乙醇胺孵育。酒精梯度脱水，空气干燥。42 ℃预杂交2 h。42 ℃于湿盒中杂交10~18 h( 杂交时探针序列同Real time-PCR) 。杂交后经依次经( 2×SSC、l×SSC、0.1×SSC) /0.1% SDS 43 ℃洗涤;Buffer Ⅰ 室温孵育10 min，Buffer Ⅱ 37 ℃孵育30 min。加入抗地高辛抗体4 ℃过夜。显微镜观察结果并拍片。实验在相同的条件下重复3 次，每次均设阴性对照。

　　1.8　　　统计学方法 各实验数据均以■±s表示，采用单因素方差分析。P< 0.05示差异有统计学意义。

　　2　　结果

　　Real-time PCR结果显示β1，4-GalT I在坐骨神经夹伤(图1A)及切断1 w(图1C)脊髓中表达最高，而在背根神经节中的表达高峰出现在坐骨神经夹伤1 d(图1B)及坐骨神经切断2 d时(图1D)。

　　原位杂交显示β1，4-GalT I mRNA在正常脊髓中呈低表达，在灰质中可见少量的阳性信号(图2B);而在坐骨神经损伤1 w后脊髓中的表达明显增高(图2C)，在灰质和白质均可见大量的阳性信号。正义β1，4-GalT I cRNA 探针未检测到阳性信号(图2A)。

　　原位杂交显示β1，4-GalT I mRNA在夹伤1 d(图3A，C-E)和切断2 d(图3F-J)背根神经节中呈高表达，可见大量阳性信号，正常背根神经节中也有表达(图3B)。β1，4-GalT I cRNA原位杂交与S-100(图3D，I)免疫组化联合检测发现背根神经节中β1，4-GalT I mRNA主要表达于神经元中，与卫星细胞基本没有共定位。

　　3 讨 论

　　β1，4-GalT I是重要的合成外部N-寡糖链的糖基转移酶之一。Zhou等发现小鼠大脑在胚胎13~17天，β1，4-GalT I的表达达到最高峰，此时正为神经系统发育高峰时期，以后随脑发育过程而下降[6]。β1，4-GalT I在细胞的生理和病理情况下发挥着多种功能，例如在小鼠卵细胞的受精反应;间充质细胞和神经嵴细胞的迁移;桑椹胚后期密集过程;表皮细胞增殖;肿瘤细胞转移及神经元轴突的延伸等生理和病理过程中，β1，4-GalT I作为细胞膜黏附分子发挥重要的作用[7-9]。

　　坐骨神经夹伤后神经外膜依然保持完整，有利于轴突生长及神经肌肉的接触，损伤近侧端神经纤维可沿基底膜伸长入神经远侧端或原来的靶组织[10]，从而有利于肌肉再生。相比较而言，坐骨神经切断后神经的连续性被破坏，且基底膜的完整性遭到破坏，近端的神经纤维不能准确地进入原来相匹配的远侧端神经纤维和靶组织[11] ，导致肌肉的去神经化。有报道认为β1，4-GalT I对施万细胞的增殖是通过对细胞周期相关因子的影响来完成的[12]，本研究结果发现β1，4-GalT I在坐骨神经夹伤及切断1 w脊髓中表达最高，而在背根神经节中的表达高峰出现在坐骨神经夹伤1 d及坐骨神经切断2 d时。这种β1，4-GalT I在不同损伤背根神经节中表达高峰时期的差异可能与损伤本身的性质有关，即可能与其基膜是否完整有关，基膜的完整性遭到破坏可能是导致β1，4-GalT I在背根神经节中表达高峰延期的一个重要原因。

　　原位杂交显示β1，4-GalT I mRNA在正常脊髓中呈低表达，在灰质中可见少量的阳性信号;而在坐骨神经损伤1 w后脊髓中的表达明显增高，在灰质和白质均可见大量的阳性信号。β1，4-GalT I mRNA在夹伤1 d和切断2 d背根神经节中呈高表达，可见大量阳性信号，正常背根神经节中也有表达。所有这些研究结果表明坐骨神经损伤可诱导β1，4-GalT I mRNA在相应节段背根神经节及脊髓中的表达增加，其中背根神经节中的变化时间较脊髓时间早，可能是背根神经节距损伤坐骨神经较脊髓近的缘故。同时，研究发现β1，4-GalT I mRNA在背根神经节中主要分布于神经元，而在脊髓中无论是灰质还是白质中均有分布，说明其在神经胶质中也有表达。提示在外周神经损伤过程中β1，4-GalT I不仅在坐骨神经中发挥一定的作用，在相应节段的脊髓及背根神经节中也发起一定的作用。

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