脑室内注射胰岛素对大鼠全脑缺血后海马CA1区Bcl

　　作者：李兵，章翔，蒋小帆，王彦刚，张戈　　(第四军医大学西京医院神经外科，陕西西安 710032)

　　摘要：目的 观察胰岛素对全脑缺血后海马CA1区Bcl2 mRNA含量变化及其蛋白表达的影响，探讨胰岛素保护作用的机制。方法 利用4VO法制作大鼠全脑缺血模型。造成脑缺血15min后行再灌注 ，治疗组于再灌注后即刻经脑室注入1u胰岛素(10μL，1×105u/L)，缺血组则经脑室注入10μL生理盐水。利用反转录PCR(RTPCR)、免疫组化及Westernblot法分别于全脑缺血后1、3、5d观察海马CA1区Bcl2蛋白表达及其mRNA相对含量的变化。结果 全脑缺血后1、3、5d治疗组海马CA1区可见呈阳性表达的Bcl2蛋白，而缺血组海马CA1区Bcl2蛋白的表达则呈阴性;Westernblot分析，全脑缺血后1、3、5d治疗组海马CA1区Bcl2蛋白电泳条带密度分别为2890.791±213.616，3147.396±243.561和2594.834±204.736，明显高于缺血组的743.376±84.123，804.637±64.547和637.867±54.394(P<0.01)。全脑缺血后1、3、5d缺血组及胰岛素治疗组海马CA1区Bcl2 mRNA相对含量则未见明显差异。结论 全脑缺血后脑室内注入胰岛素可能通过促进海马CA1区神经元Bcl2基因的翻译途径从而促进Bcl2蛋白表达，这可能是其对全脑缺血后海马CA1区神经元产生中枢直接保护作用的主要机制之一 。

　　关键词：胰岛素;脑缺血;Bcl2

　　The effect of intraventricular administration of insulin on expression of Bcl2 mRNA and protein in rat hippocampal CA1 region following global brain ischemia

　　Li Bing, Zhang Xiang, Jiang Xiaofan, Wang Yangang, Zhang Ge

　　(Department of Neurosurgery, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, Xian 710032, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the mechanism of neuroprotective effect of insulin on hippocampal CA1 region, the relatively content of Bcl2 mRNA and the expression of Bcl2 protein in rat hippocampal CA1 region following global brain ischemia were observed. Methods Fourvessel occlusion was used to establish the rat global brain ischemic model. After 15 minutes brain ischemia, 1 unit insulin (10μL, 1×105u/L) was injected into the cerebral ventricular immediately post reperfusion in treated group, while, 10μL NaCl (90g/L) solution was injected into the cerebral ventricular at the same time in ischemic group. The relatively content of Bcl2 mRNA and the expression of Bcl2 protein in hippocampal CA1 region had been detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR), immunocytochemistry, and Westernblot, respectively. Results The expression of Bcl2 protein was negative in ischemic group and was positive in treated group, in 1, 3, 5 day post brain ischemia. While, Westernblotting analysis showed that the density of electrophoretic strip of Bcl2 protein was 2890.791±213.616, 3147.396±243.561 and 2594.834±204.736 in treated group. It was much higher than that in ischemic group, which was 743.376±84.123, 804.637±64.547 and 637.867±54.394, respectively. But, the relatively content of Bcl2 mRNA had no obvious difference between ischemic group and treated group. Conclusion Intraventricular administration of insulin can improve the expression of Bcl2 protein by up regulating the translation of the Bcl2, and this may be the main point to achieve the neuroprotective effect on hippocamal CA1 region post global brain ischemia.

　　KEY WORDS: insulin; brain ischemia; Bcl2

　　自1978年首次在大鼠脑组织的提取物中发现有胰岛素及其受体以来，一些研究相继发现在其他哺乳动物及人类脑中也具有胰岛素及其受体的存在。胰岛素在中枢神经系统中的作用引起了广泛的注意。在缺血性脑损伤的研究过程中，人们通过动物实验发现，全脑缺血再灌注后使用胰岛素，可减轻神经元的死亡或脱失，且这种作用在使用葡萄糖抵销其降糖作用后并不减弱，表明胰岛素在全脑缺血再灌注过程中可不依赖其外周降血糖作用而发挥神经保护作用。但胰岛素对缺血性脑损伤产生中枢保护作用的详细机理目前仍不甚明了。近年来许多文献报道,脑缺血后神经元的凋亡是缺血造成中枢神经系统损伤的一个重要原因。我们以往的研究证实，胰岛素对缺血性脑损伤具有中枢直接保护作用并可减少大鼠海马CA1区神经元的凋亡[1]。为进一步探讨胰岛素对缺血性脑损伤产生中枢直接保护作用的机理，我们对在脑缺血再灌注后，经脑室内注入胰岛素，对大鼠海马CA1区Bcl2mRNA相对含量变化及其蛋白表达的影响进行了观察。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 采用健康成年雄性SD大鼠，共72只(清洁级)，体重(300±20)g，由第四军医大学动物实验中心提供。随机分为 ①缺血组：缺血再灌注后1、3、5d分别取材，每个时间点12只。②胰岛素治疗组：取材时间点及每个时间点的动物数同缺血组。

　　1.2 动物模型制作 大鼠经20g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射后，俯卧位固定于立体定向架上，于颈后正中第一、二颈椎处，切一长约1.5cm切口，剥离颈部肌肉显露第一颈椎上之双侧翼孔后，插入双极电凝镊，烧灼闭塞从中穿行的椎动脉，缝合伤口，置笼喂养。24h后，同法麻醉，于头顶部皮下插入针状电极，仰卧位固定。分离颈部肌肉，显露双侧颈总动脉，夹闭30s后描记脑电变化，以脑电变成直线为模型成功的标准。夹闭15min后放开动脉夹，行再灌注。于放开动脉夹后即刻，以前囟后1.2mm、中线旁开1.5mm为穿刺点。颅骨钻孔后，用微量加样器垂直进针3.5mm穿刺脑室，缺血组注入10μL生理盐水，治疗组注入1u (10μL，1×105u/L)速效基因合成人胰岛素(丹麦诺和灵公司)。

　　1.3 血糖测定 各组鼠分别于颈总动脉夹闭前及再灌注后30min、1、2、6、12、24h自鼠尾静脉取血约50μL，用血糖测定仪(Lifescan)测定血糖。

　　1.4 标本采集 于规定时间，麻醉后开胸显露心脏，自左心室插管至主动脉，剪开右心房，经预冷生理盐水冲净血液。每组每个时间点12只大鼠，其中4只以预冷之40g/L多聚甲醛灌注固定2h，断头取脑，前囟处以美兰标记，置40g/L多聚甲醛中固定4h，系列脱水，石蜡包埋，冠状切片，收取前囟后3.8mm处相邻切片两张(6μm)行免疫组化观察;4只断头取脑，剥离海马，切取双侧海马CA1区组织100mg，迅速置入液氮保存用于Westernblot检测。4只以焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的0.01mol/L PBS(4℃)50mL灌注，冲净血液，冰盒内断头取脑。快速剥离海马，切取双侧海马CA1区组织100mg，立即在干冰上冷冻，保存于-80℃冰箱。

　　1.5 海马CA1区Bcl2 mRNA相对含量的测定

　　1.5.1 总RNA提取 采用异硫氰酸胍法提取总RNA。获取的总RNA用分光光度计测量纯度及浓度后置-80℃保存备用。

　　1.5.2 反转录合成cDNA 在50μL的反应体积中加入5μg总RNA，10μL 反应缓冲液，5μL 10mol/L dNTPs，0.5μL Rnasin(40u/μL)，0.25μg oligo(DT)12-18，4μL 反转录酶(200u/μL)，0.5μL 0.1mol/L DTT，置37℃孵育1h，然后于65℃加热5min，储存于-30℃。

　　引物设计及合成按照已报道[2]的Bcl2 cDNA设计其相应的特异性引物(引物序列5′CACCCCTGGCACTTCTCCTTC3′;5′CACAATCCTCCCCCAGTTCACC3，扩增产物长度303bp)。大连宝生物公司合成。

　　1.5.3 PCR扩增 在25μL的反应体积中加入合成的cDNA 0.1μg，2.5μL 10×PCR缓冲液，2.5μL 2mol/L dNTPs，2.5μL 25mol/L MgCl2，1μL各引物(pmol/μL)，0.5μL Taq DNA聚合酶(5u/μL)。使用PTC100 PCR仪进行热循环。循环条件：93℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1min，进行一个循环;93℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1min，进行32个循环;72℃ 延伸8min。取扩增产物10μL，经30g/L琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统进行检测，用Labworks软件对各阳性条带的密度进行分析，计算各阳性条带的平均密度值与βactin条带平均密度值之比。

　　1.6 Bcl2蛋白表达的观察 将获取的切片脱蜡至水，置入枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)行微波抗原修复10min;冲洗后滴加3%(体积分数)H2O2 阻断内源性酶15min，冲洗5min;滴加Bcl2抗体(Stanta Cruz，1∶1000)50μL，4℃孵育过夜，PBS冲洗，参照SABC试剂盒说明(博士德公司)分别滴加二抗及StreptavidinPeroxidase，DABH2O2混合液显色，封片，镜下观察。

　　1.7 Westernblot

　　1.7.1 蛋白提取及浓度测定 将收取的脑组织置提取缓冲液中制成匀浆，4℃，15000r/min离心20min，收集上清，移入另一管中(浆蛋白)于溶解缓冲液中溶解沉淀，室温静置30min ，取上清移入另一管中(膜蛋白)，置于-70℃保存。用Bradford法测定蛋白含量。

　　1.7.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 将蛋白样品与样品缓冲液混合(4∶1)，每孔蛋白为50μg，总体积20μL;将样品加热至100℃×3min，旋转3s;将样品溶液加入加样孔，20mA恒流下电泳。

　　1.7.3 Westernblotting 电泳后，将凝胶中的蛋白转至硝酸纤维素膜(NC)上，20g/L脱脂乳/TBS处理NC膜，室温下将NC膜置入含有Bcl2一抗(1∶1000，含5g/L脱脂乳/TBS)孵育1-4h，TBST缓冲液洗10min×3次， 室温下，将NC膜分别置入含有二抗的稀释液中(酶标羊抗兔IgG， 1∶5000，含5g/L脱脂乳/TBS)孵育1h，TBST缓冲液洗10min×3次。将膜浸入AP缓冲液，显色(10×AP缓冲液1mL，0.1mol/L MgCl2 0.5mL，D.W. 8.5mL，BCIP 30μL，NBT 40μL)10min，观察各阳性条带，用Labworks软件对阳性条带的密度进行分析，计算各阳性条带的平均密度值。

　　1.8 统计学处理 采用SPSS统计软件行统计学处理，数据用±s表示，行组间方差分析。

　　2 结果

　　2.1 全脑缺血后血糖的变化 全脑缺血前后各组鼠血糖浓度无明显差异。缺血组与治疗组比较血糖浓度则无显著差异(表1)。

　　表1 各实验组血糖浓度变化(略)

　　Table 1 The changes of blood glucose in different group

　　*P>0.05 vs. ischemic group

　　2.2 全脑缺血后海马CA1区Bcl2 mRNA相对含量的变化 在缺血组及胰岛素治疗组海马CA1区，于各取材时间点均可见Bcl2 mRNA的阳性电泳条带(图1)。利用Labworks软件对各阳性条带平均密度进行测量，计算各阳性条带的平均密度值与βactin条带平均密度值之比，结果全脑缺血后1、3、5d胰岛治疗组与缺血组比较无显著差异(表2)。

　　表2 缺血组及治疗组海马CA1区Bcl2 mRNA的相对含量(略)

　　Table 2 The relatively content of Bcl2 mRNA of hippocampal CA1 region in ischemic and treated group

　　*P>0.05 vs. ischemic group

　　图1 脑缺血后海马CA1区Bcl2 mRNA RTPCR 电泳条带(略)

　　Fig.1 The electrophoretic strip of Bcl2 mRNA with RTPCR from hippocampal CA1 region post brain ischemic

　　1, 3, 5: the electrophoretic strip of Bcl2 mRNA of ischemic group in 1,3,5 day, respectively; 2,4,6: the electrophoretic strip of Bcl2 mRNA of insulin treated group in 1,3,5 day, respectively

　　2.3 全脑缺血后海马CA1区Bcl2蛋白的表达 全脑缺血后1、3、5d，缺血组海马CA1区Bcl2蛋白表达为阴性，而胰岛素治疗组海马CA1区Bcl2蛋白表达则呈阳性(图2)。

　　2.4 全脑缺血后海马CA1区组织Westernblot结果 全脑缺血后1、3、5d胰岛素治疗组Bcl2蛋白电泳条带密度(图3)均高于缺血组(P<0.01)。表明全脑缺血后经脑室注入胰岛素可提高大鼠海马CA1区Bcl2蛋白的表达(表3)。

　　表3 海马CA1区Bcl2蛋白电泳条带密度(略)

　　Table 2 The density of electrophoretic strip of Bcl2 protein from hippocampal CA1 region

　　*P< 0.01 vs. ischemic group

　　图2 全脑缺血再灌注后1、3、5d海马CA1区神经元Bcl2蛋白表达(略)

　　Fig.2 The expression of Bcl2 in hippocampal CA1 region in 1,3,5 day post global brain ischemia (×400)

　　A-C: the expression of Bcl2 was negative in hippocampal CA1 region in 1,3,5 day post global brain ischemia in ischemic group, respectively;

　　D-F: the expression of Bcl2 was positive in hippocampal CA1 region in 1,3,5 day post global brain ischemia in insulin treated group, respectively

　　图3 脑缺血后海马CA1区Bcl2蛋白Westernblot电泳条带(略)

　　Fig.3 The electrophoretic strip of Bcl2 protein by Westernblot from hippocampal CA1 region post brain ischemia

　　1: positive control; 2, 4, 6: the electrophoretic strip of Bcl2 protein in 1,3,5 day in ischemic group, respectively; 3,5,7: the electrophoretic strip of Bcl2 protein in 1,3,5 day in insulin treated group, respectively

　　3 讨论

　　缺血性脑血管病是威胁人类健康的重大疾病之一，随着对缺血后脑致伤机理研究的深入，目前认为缺血性脑损伤的病理生理机制是一种损伤级联反应。针对级联反应不同阶段的致伤特点，寻找相应的神经保护剂阻断损伤反应级联，减少神经元的死亡是缺血性脑损伤研究中的一个热点。

　　胰岛素为一种血糖调节激素，其介导的降血糖效应对减轻缺血性脑损伤具有一定的保护作用。大量动物实验证实，脑缺血后将血糖降至正常低限水平可减轻缺血造成的神经元损害。因而早期被应用于脑缺血病人，尤其是同时患有糖尿病患者的治疗当中并取得了较好的疗效。自证实哺乳动物及人类脑中存在有胰岛素及其受体后，胰岛素在中枢神经系统中的作用引起了人们的重视。

　　近年来一些实验研究发现，全脑缺血后经外周血给予胰岛素的同时给予葡萄糖抵消其降糖作用可减轻缺血造成的脑损害，提示胰岛素对缺血性脑损害具有中枢直接保护作用[34]。我们此前的研究也证实胰岛素可减少大鼠全脑缺血后海马CA1区神经元的凋亡并可减轻全脑缺血后大鼠的记忆力损害，其产生抗凋亡作用的机理与促进Bcl2蛋白表达有关。

　　Bcl2基因家族在细胞凋亡中具有重要的调控作用。在Bcl2基因家族中，目前已鉴定出有超过20种基因，包括抑制凋亡的Bcl2、Bclxl、Bclx、Bcl1和促进凋亡的Bax、Bak、Bad、Bclxs、Bik等成员，两类分子的比例决定了细胞是否发生凋亡。Bcl2基因家族对调节线粒体通透性具有关键的作用。在Bcl2基因家族中抑制凋亡的主要成员如Bcl2等基因的表达降低，促进凋亡成员如Bax过表达，均可导致线粒体通透性的增加，可使细胞色素C自线粒体中释放进入细胞浆中[56]，并与Apaf1及Caspase9的前体结合，形成复合物。而后，Caspase9的前体裂解，形成Caspase9并被激活。使其他Caspase家族成员裂解并被激活，其中包括Caspase3[7]。Caspase3的激活目前被认为是起始细胞凋亡的关键点。Caspase3可激活许多细胞底物，其中最主要的有PARP(聚ADP核糖多聚酶)，DNA蛋白激酶，DNA裂解因子。这些蛋白的水解直接导致与细胞凋亡相关特征的出现(如DNA修复的停止，染色体的聚集和细胞核内DNA的断裂等)[89]。由此可见，Bcl2基因家族在细胞是否发生凋亡中具有重要的调控作用。

　　一些研究发现，全脑缺血后海马CA1区神经元的迟发性死亡可能是一个细胞凋亡的过程[10]，Bcl2蛋白在脑缺血再灌注后中枢神经系统中的作用受到了重视[1112]。Kitagawa等[13]在神经元过表达Bcl2基因的转基因小鼠上观察到，全脑缺血再灌注后7d，转基因鼠海马CA1区神经元的死亡数明显少于同源的非转基因鼠。Antonawich等[14]甚至将携带Bcl2基因的逆转录病毒于全脑缺血前24 h种植于鼠海马CA1区，使其转染神经元，全脑缺血后72h观察发现，于种植区周围的神经元Bcl2蛋白呈阳性表达，且神经元存活数明显高于未转染区[14]。从而进一步证实Bcl2蛋白具有减轻全脑缺血后海马CA1区神经元凋亡的作用。

　　为进一步探讨全脑缺血后胰岛素减少海马CA1区神经元凋亡机制，本实验通过制作大鼠全脑缺血再灌注模型，于全脑缺血再灌注后即刻经脑室直接注入胰岛素，对血糖及海马CA1区的Bcl2基因的mRNA和蛋白表达情况进行了观察。结果显示，再灌注即刻经脑室注入1u胰岛素后，全脑缺血前后各组鼠血糖浓度无明显变化，缺血组与治疗组比较血糖浓度亦无显著差异;全脑缺血后1、3、5d，胰岛素治疗组海马CA1区Bcl2基因的mRNA表达与缺血组无显著差异，而Bcl2蛋白的表达却明显高于缺血组。结果证实，胰岛素促进鼠海马CA1区Bcl2蛋白表达的作用可能是通过促进Bcl2蛋白的翻译过程而实现的，而并不依赖胰岛素的外周血糖调节效应及其中枢直接作用。

　　因此我们认为，全脑缺血后经脑室内注入胰岛素可能通过促进Bcl2蛋白翻译过程，使大鼠海马CA1区Bcl2蛋白高表达抑制海马CA1区神经元的凋亡，从而发挥中枢直接保护作用。

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