GST-π和P-gp在人脑胶质瘤的表达及与患者生存期的关系

　　作者：孙彦辉 张亚卓 王忠诚 孙梅珍 赵东海 作者单位:100050北京市神经外科研究所

　　【摘要】 目的 通过分析GST-π和P-gp在脑胶质瘤的表达及与患者生存期的关系，为基于耐药机制上的脑胶质瘤分子分类奠定基础。方法 通过组织芯片技术和免疫组织化学方法分析了314例脑胶质瘤石蜡标本中GST-π和P-gp的表达情况，并对所有患者进行了手术后的5年随访。结果 GST-π表达的阳性率为14.85%，P-gp表达的阳性率为20.97%，其平均年龄和性别与表达阴性者进行的t检验和χ 2 检验分析，结果分别为P>0.05，各组之间差异都没有显著性;在Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤中GST-π和P-gp表达的阳性率分别为11.11%和16.76%，而在Ⅲ～Ⅳ级中阳性率分别为25.12%和27.20%，经χ 2 检验分析，P<0.05，差异具有显著性;将GST-π和P-gp不同表达患者的生存期绘制成Kaplan-Meier生存曲线，并进行Log-rank test分析，P<0.05，差异都具有显著性。 结论 GST-π和P-gp在脑胶质瘤的表达与患者的年龄、性别无关，而与肿瘤的恶性程度有关，并且都与患者的生存期相关。

　　关键词 人胚胎型谷胱甘肽S转移酶 P-糖蛋白 组织芯片 胶质瘤 生存期

　　Relationship between expression of Glutathione S-transferase πand P-glycoprotein in gliomas and the survival of the patients.

　　Sun Yanhui，Zhang Yazhuo，Wang Zhongcheng，et al.

　　Beijing Neurosurgical Institute，Beijing100050.

　　【Abstract】 Objective To analyze the relationship between expression of Glutathione S-transferaseπand P-glycoprotein in gliomas and the survival of the patients.Methods The expression of Glutathione S-transferaseπand P-glycoprotein in314samples of gliomas were examined using immunohistochemistry on tissue chip，all patients had been followed up for five years，and the materials were analyzed statistically.Results The positive rate of Glutathione S-transferaseπand P-glycoprotein were11.11%and16.76%，that of Glutathione S-transferaseπand P-glycoprotein were11.11%，25.12%and16.76%，27.20%respectively inⅠ～ⅡandⅢ～Ⅳgrade gliomas，using t test，P<0.05.According to the Kaplan-Meier’s survival curves and Log-rank test，P<0.05，these patients with Glutathione S-transferaseπand P-glycoprotein positive expression showed a short survival than those with no expression.Concluˉsion The expression of Glutathione S-transferaseπand P-glycoprotein in gliomas are not relative to the age and genˉder of patients，but are correlat

　　ed with histological grade and the survival of patients.

　　Key words Glutathione S-transferaseπ P-glycoprotein tissue chip gliomas survival

　　脑胶质瘤是最常见的人脑肿瘤，尽管治疗已经发展到今天的手术、放疗和化疗等综合治疗，但是在过去的几十年里，患者的预后并没有得到明显的改善 [1] 。一些研究资料已经证实人胚胎型谷胱甘肽S转移酶Glutathione S-transferase，GST-π)和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)在胶质瘤中的表达参与了肿瘤的不同耐药机制，并可能影响到患者的预后。

　　笔者收集了1997年1月～1998年12月314例在北京天坛医院接受手术治疗患者的脑胶质瘤 石蜡组织标本，通过组织芯片技术进行了GST-π和P-gp的免疫组织化学分析，并对患者的生存期进行了随访调查，探讨了GST-π和P-gp在人脑胶质瘤中的表达及与患者生存期之间的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 一般资料 314例原发性脑胶质瘤的石蜡组织标本，进行常规组织病理学检查，诊断为星形细胞瘤的122例，少枝胶质细胞瘤70例，少枝星形细胞瘤65例，多形性胶质母细胞瘤57例。根据2000年WHO有关神经系统肿瘤的分类方法，对肿瘤进行了分级，其中符合胶质瘤Ⅰ级的5例，Ⅱ级的182例，Ⅲ级的70例，Ⅳ级的57例。其中男192例，女122例，年龄最小者2岁，最大者71岁，平均年龄37.11±13.47岁。所有肿瘤患者手术前未经过任何放疗和化学药物的治疗。

　　1.2 患者随访 所有患者都进行了手术后5年的生存期随访调查，其中生存期(S)<1年的29例，1年≤S<2年的49例，2年≤S<3年的53例，3年≤S<4年的37例，4年≤S<5年的56例，S>5年的90例。

　　1.3 组织芯片制作 (1)对肿瘤组织蜡块进行切片及HE染色，复核诊断，选择最能够代表肿瘤组织特点的区域在玻片上作标记;(2)在受体蜡块上打孔，打孔针的直径为2mm。组织芯片制作机为Beecher Instruments产品。(3)借助玻片上的标记找准供体蜡块上的相应部位，打孔采集组织芯;(4)将组织芯转移到受体蜡块的孔中―制成了组织芯片蜡块(每个蜡块的组织芯密度为6×7～6×8)。(4)将胶膜贴在组织芯片蜡块表面，然后进行4～8μm的连续切片，组织切片机为德国Leica公司产品，型号RM2145。切下的组织平整地粘在胶膜上，再将有组织的一面放在光胶玻片上，然后放在紫外线灯下照射30s左右，此时组织与光胶玻片牢固粘连，去掉胶膜后便制成了组织芯片。

　　1.4 免疫组化方法 GST-π和P-gp的免疫组化染色采用DAB显色方法，一抗均为鼠抗人单克隆抗体，抗体滴度均为1:500。GST-π为细胞核与细胞质着色，在高倍镜(×400)下有3个以上细胞明显棕染的为阳性，无细胞棕染或染色较淡者为阴性。P-gp为细胞膜与细胞浆着色，在高倍镜(×400)下有3个以上细胞明显棕染的为阳性，无细胞棕染或染色较淡者为阴性。

　　1.5 统计学分析 采用SPSS10.0分析软件系统进行统计学处理分析，其中GST-π和P-gp的表达情况与患者生存期的关系应用Kaplan-Meier生存曲线表示，并进行Log-rank test差异显著性分析。

　　2 结果

　　在GST-π免疫组化染色过程中出现标本脱片情况11例，最后剩下可观察记录的标本303例。在P-gp免疫组化染色过程中出现标本脱片情况4例，最后剩下可观察记录的标本310例。组织芯片的免疫组化染色见附图1，GST-π和P-gp表达阳性者见附图2，3。303例标本中GST-π表达阳性者45例，占14.85%，其平均年龄为36.68±13.04岁;GST-π表达阴性者258例，占85.15%，平均年龄39.96±15.32岁，将两组的平均年龄进行t检验分 析(见表1)，结果P>0.05，两组之间差异没有显著 性。310例标本中P-gp表达阳性者65例，占20.97%，其平均年龄为38.06±14.81岁;P-gp表达阴性者245例，占79.03%，平均年龄36.83±13.06，将两组的平均年龄进行t检验分析(见表1)，结果P>0.05，两组之间差异也没有显著性。 表1 GST-π表达与患者年龄t检验分析例数 将GST-π的表达和P-gp的表达与脑胶质瘤患者的性别进行χ 2 检验分析，结果P值均>0.05，差异都没有显著性(见表2)。表2 GST-π表达情况与患者性别χ 2 检验分析性别 表3 GST-π表达与肿瘤病理级别χ 2 检验分析病理级别 表3显示了低度恶性肿瘤组和高度恶性肿瘤组GST-π和P-gp的表达情况。在低度恶性肿瘤组的180例标本中GST-π表达阳性者为20例，占11.11%;在高度恶性肿瘤组的123例中GST-π的阳性表达者25例，占25.12%，将两组GST-π的表达情况进行χ 2 检验分析，结果P<0.05，差异具有显著性。P-gp的阳性表达在185例低度恶性肿瘤中为31例，占16.76%，在125例高度恶性肿瘤中为34例，占27.20%，将两组P-gp的表达情况进行χ 2 检验分析，结果P<0.05，差异也具有显著性。将GST-π和P-gp表达的情况与患者生存时间的关系分别制作成Kaplan-Meier生存曲线(见附图4，5)，经Log-rank test差异显著性分析，结果P值都均<0.05，差异都具有显著性。

　　3 讨论

　　有关肿瘤对化疗药物的多药耐药性的研究一直是人们普遍关注的难题，目前的研究已经证实肿瘤耐药的机制主要包括:(1)多药耐药基因扩增及P-糖蛋白表达;(2)DNT拓扑异构酶的变化;(3)GSH/GST解毒酶系统作用增强;(4)抗代谢产物等。本研究采用能够进行大样本、平行操作的组织芯片技术，通过免疫组织化学的方法对与脑胶质瘤耐药密切相关的GST-π和P-gp在人脑胶质瘤组织中的表达情况进行了研究分析。

　　在303例脑胶质瘤标本中，GST-π表达阳性者45例，阳性率为14.85%;在310例脑胶质瘤标本中P-gp表达阳性者65例，阳性率为20.97%。经过t检验分析，结果显示GST-π和P-gp的表达与患者的年龄无关。将GST-π和P-gp的表达与脑胶质瘤患者的性别进行χ 2 检验分析，结果显示性别之间的差异也没有显著性。

　　通常认为Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤属于低度恶性，而Ⅲ～Ⅳ级则属于高度恶性。表3显示了低度恶性肿瘤组和高度恶性肿瘤组GST-π和P-gp的表达情况，经过χ 2 检验分析，结果P<0.05，差异具有显著性。这说明GST-π和P-gp的表达与肿瘤的恶性程度具有一定的关系，即高度恶性胶质瘤GST-π和P-gp的阳性表达要多于低度恶性肿瘤。

　　本研究将GST-π与P-gp表达阴性和阳性患者的生存期分别绘制成了Kaplan-Meier生存曲线，并经过差异显著性分析，结果差异都具有显著性，表明GST-π表达阴性的患者生存期要明显长于表达阳性的患者，P-gp表达阴性的患者生存期也要明显长于表达阳性的患者。GST-π和P-gp的表达增加了肿瘤的耐药性可能是原因，但是否是唯一原因，尚有待于今后进一步研究。谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase，GST)被认为是一种肿瘤标志物，在许多肿瘤中呈过度表达，对肿瘤的诊断、治疗及预后判断具有指导意义。近年来，国外的一些研究报道认为GST在人脑胶质瘤中呈过度表达，胶质瘤的恶性程度愈高，GST表达愈高，预后愈差，并且与肿瘤的耐药性有一定的关系 [2～6] 。本研究通过检测GST-π在脑胶质瘤中的表达情况，证明了GST-π的确与患者的年龄和性别无关，但是与肿瘤的恶性程度具有一定的关系，即恶性程度高的肿瘤GST-π表达增强，而

　　且GST-π的表达与患者的生存期具有一定的相关性，也就是说， GST-π呈阳性表达的患者生存期相对较短，而无GST-π阳性表达的患者生存期相对较长。因此，GST-π是判断脑胶质瘤恶性程度、耐药性以及患者预后方面的一个重要的分子生物学指标，进行GST-π的免疫组化分析有助于指导脑胶质瘤的个体化治疗。此外，本研究还发现GST-π在脑胶质瘤中有时呈灶性表达(见附图2)。在取材只有2mm直径的肿瘤组织中，GST-π的表达特点就存在着如此大的差异，说明整个肿瘤中GST-π的表达是不均匀的，就是说，同一肿瘤中的不同细胞株GST-π的表达是不一致的。因此，外科手术是否完全切除了肿瘤耐药细胞株，可能会直接影响到术后的化疗效果。P-gp是肿瘤多药耐药基因(MDR-1)编码的ATP依赖性糖蛋白，其过度表达也是肿瘤多药耐药的分子基础之一，当有关抗肿瘤药物进入耐药肿瘤细胞后，P-gp即与该分子相结合，将药物主动转运到细胞外，由此形成耐药。脑胶质瘤化疗的效果不佳与P-gp的表达有关 [7～9] 。Sadnand等 [10] 报道应用P-gp抑制剂―PSC833能够在体外抑制星形细胞瘤系的肿瘤细胞的生长，并且可以诱导细胞死亡。本研究通过检测P-gp在脑胶质瘤中的表达情况，证明了P-gp与患者的年龄和性别无关，但是与肿瘤的恶性程度具有一定的关系，即恶性程高的肿瘤P-gp表达增强，而且P-gp的表达与患者的生存期具有一定的相关性，也就是说，P-gp呈阳性表达的患者生存期相对较短，而无P-gp阳性表达的患者生存期相对较长。因此，P-gp也是判断脑胶质瘤恶性程度、耐药性以及患者预后方面的一个重要的分子生物学指标，进行P-gp的免疫组化分析也有助于指导脑胶质瘤的个体化治疗。有报道认为P-gp在血管内皮细胞中的表达对维持血脑屏障的完整性阻止有害物质进入脑内方面具有重要的作用 [11～13] 。本研究中也发现P-gp在脑胶质瘤血管内皮细胞中存在一定的表达(见附图3)，本次研究只是观察P-gp在肿瘤细胞中的表达情况，并没有将血管内皮细胞中的表达情况计算在内。但是否P-gp在血管内皮细胞中的表达情况也影响到了肿瘤的耐药机制，本研究尚不能够说明。(本文附图见封三)

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