损伤反应性星形胶质细胞对成年大鼠室下区的再生作用

　　作者：屈建强　贺西京　杨平林　杨涛 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院神经外科，陕西西安 710004;西安交通大学医学院第二附属医院骨二科，陕西西安 710004;安康市中心医院神经外科，陕西安康 725000

　　【摘要】目的 ①观察液压性脑损伤后不同时期室下区Nestin和GFAP的表达及其细胞类型。②分离脑损伤室下区Nestin+/GFAP+共存细胞进行培养、诱导分化鉴定。方法 ①用液压冲击法建立SD大鼠动物模型，用免疫组化和免疫荧光双标法分析和显示不同时期(1、3、5d，1、2、3、4、6、8周)Nestin和GFAP的表达变化以及细胞类型。②分离液压损伤SD大鼠室下区Nestin+/GFAP+共存细胞，制成单细胞悬液，进行培养、传代，以免疫荧光化学方法对原代和传代培养形成的神经球以及诱导分化的细胞进行鉴定。结果 ①室下区免疫荧光染色：正常组及空白对照组在前脑侧脑室SVZ区出现神经干细胞，主要集中在外侧壁上部和上角，其他部位及三脑室的SVZ区有少量神经干细胞。脑损伤模型组脑损伤24h后，和正常组相比，室下区Nestin和GFAP的表达显著增加，阳性表达在3d后逐渐达到高峰，持续1周。②在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经球;神经球贴壁后分化的细胞表现为少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的形态，且分别呈GalC阳性、βtublin Ⅲ阳性和GFAP阳性。结论 ①成年大鼠液压性脑损伤可诱导室下区表达Nestin和GFAP，Nestin的表达和反应性星形胶质细胞增生呈正相关，且表达多相互共存，并且具有星形胶质细胞的形态;室下区的星形胶质细胞和神经干细胞都对脑损伤都有反应，并可能参与中枢神经系统损伤修复。②成年大鼠液压性脑损伤后分离的室下区细胞具有自我更新能力和多分化潜能，可以分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，是中枢神经系统的干细胞。

　　【关键词】 脑损伤;反应性星形胶质细胞;神经干细胞;再生;室下区

　　Effects on regeneration in subventricular zone about injuried　reactive astrocyte following brain injury in adult rats

　　Qü Jianqiang, He Xijing, Yang Pinglin, Yang Tao

　　(Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710004; Second Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004; Department of Neurosurgery of Ankang Central Hospital, Ankang 725000, China)

　　ABSTRACT: Objective ① Using immunohistochemical method and immunofluorescence, the expressions of Nestin and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in subventricular zone of rats with hydraulic injury, as well as its cell types were observed in different period. ② The coexisting cells of Nestin+/GFAP+ were cultured and induced to differentiate. Methods ① Animal model was established by moderate lateral fluid percussion. Expression and cell types of Nestin and GFAP in different period (1d, 3d and 5d; 1w, 2w, 3w, 4w, 6w and 8w) were measured by immunohistochemical method and immunofluorescence. ② Coexisting cells of Nestin+/GFAP+ were separated from subventricular zone of SD rats to make single cell suspension. And then, the cells were cultured and subcultured. Next, primary and subculturing neuronosphere as well as primary and subculturing differentiated cells were measured with immunofluorescence. Results ① Immunofluorescence staining results: For normal controls, small nerve stem cells of round or fusiform shape appeared in SVZ of prosencephalon lateral ventricle, mainly in upper part of lateral wall and corn. Few nerve stem cells were located in SVZ of lateral ventricle and 3rd brain ventricle. Brain injury: 24 hours after brain injury, expression of Nestin and GFAP increased obviously and reached the peak value 3 days later, and lasted for 1 week. ② Subcultured cells proliferated and positiveNestin neuronosphere formed. Differentiated cells were oligodendrocytes (positivegalactocerebroside), neurons (positiveβtublinIII) and orastrocytes (positiveGFAP). Conclusion ① Hydraulic injury can induce the expression of Nestin and GFAP in brain ventricle subarea of rats.The expression of Nestin has a positive correlation with reactive astrocyte regeneration and coexists with the form of astrocytes. Both astrocytes and nerve stem cells in brain subventricular zone can be responsive to injury and possibly take part in repair of CNS. ② Cells separated from brain subventricular zone have a great ability in differentiation and selfrenewing. These cells can differentiate into neurons, oligodendrocytes or astrocytes. They are stem cells of CNS. So, injury reactive astrocyte can repair CNS through regenerating the subventricular zone in adult rats.

　　KEY WORDS: brain injury; reactive astrocyte; neural stem cell; regeneration; subventricular zone

　　神经干细胞在成年动物中枢神经系统(central nervous system, CNS)中的存在，打破了CNS损伤后神经元不能再生的观念，使CNS损伤修复成为可能。而寻找干细胞资源是CNS损伤修复的关键。近年来研究表明，成年中枢神经系统中的某些星形胶质细胞具有神经干细胞的特性，经过分离、纯化及体外培养能转变为神经元和(或)星形胶质细胞[13]。

　　我们用液压冲击法建立SD大鼠脑损伤动物模型，应用免疫组织化学和免疫荧光双标技术结合激光共聚焦显微镜，观察脑损伤后不同时期室下区巢蛋白(neuroepthelial stem cell protein, Nestin)和胶质酸性纤维蛋白(glia fibrillary acidic protein, GFAP)的表达及其细胞类型，对脑损伤后Nestin+与GFAP+共存细胞表达高峰期(5-7d)的室下区神经干细胞进行培养并观察其特性。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 成年8周龄SpragueDawley大鼠66只，清洁级，雄性，体重300-350g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。随机分为正常对照组(6只)、假手术组(6只)和脑损伤模型组(54只)，其中模型组造模后分为1、3、5d，1、2、3、4、6、8周小组，每小组6只。所有动物均在室温下饲养。

　　1.2 动物模型的建立 脑损伤模型组动物按文献[4]的方法，通过液压装置骤然改变密闭颅腔内的压力而间接造成脑损伤。液压装置由圆形液柱、打击架、示波器和压力传感器组成。压力大小可由打击锤的高度调节并通过压力传感器在示波器上显示，两者保持完全一致。为排除手术和麻醉的干扰，动物在致伤前24h行颅骨钻孔硬膜外埋置打击管，并用牙托水泥固定。打击术式：以0.2MPa的压力冲击右侧顶叶皮质造成中度侧位液压冲击脑损伤。假手术组做法同上，不用液压冲击。

　　1.3 取材及标本的制备 在冲击后不同时间(1、3、5d，1、2、3、4、6、8周)，用0.12mol/L的苯巴比妥钠经腹腔麻醉(30mg/kg)，无菌条件下，经左心室快速灌注肝素生理盐水约100mL，然后用40g/L的多聚甲醛300-500mL进行灌注，灌注完毕后取室下区脑组织。在4℃下将脑移入40g/L的多聚甲醛里固定6h，然后依次移入0.58、0.88mol/L的蔗糖中直到沉底，并行水平面冰冻切片(厚14μm)备用。

　　1.4 化学、生物试剂 改良Eagle培养基(Dulbeccos modified Eagles medium，DMEM)/F12(1∶1)、胎牛血清、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)均购自美国GIBCO公司;B27添加剂、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、多聚赖氨酸、胰蛋白酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)酶均购自美国Sigma公司;Nestin抗体、GFAP抗体、β微管蛋白Ⅲ(βtublin Ⅲ)抗体均购自北京中山生物有限公司;半乳糖脑苷脂(galactocerebroside, GaLC)抗体购自美国Chemicon公司;抗兔免疫球蛋白G异硫氰酸荧光素(immunoglobulin Gfluorescein isothiocyanate, IgGFITC)、抗小鼠免疫球蛋白G四甲基若丹明异硫氰酸盐(immunoglobulin Gtetramethyl rhodamine isothiocyanate, IgGTRITC)、抗小鼠IgGFITC、抗兔IgGTRITC均购自德国罗氏公司。

　　1.5 脑组织切片组织化学染色 脑组织切片分为3组。第1组用常规甲苯胺蓝染色，以分析脑损伤的范围及程度。第2组行免疫荧光单标染色，取组织切片与兔抗大鼠Nestin抗体(1∶5000)4℃孵育过夜，抗兔IgGFITC(1∶100)37℃孵育1h;另取组织切片与小鼠抗大鼠GFAP抗体(1∶200)4℃孵育过夜，抗鼠IgGTRITC(1∶100)37℃孵育1h，甘油明胶封片后用荧光显微镜观察。用抗体稀释液替代抗体处理脑片作阴性对照。第3组行免疫荧光组织化学双重标记，选取损伤后不同时期的脑片经兔抗大鼠Nestin(1∶5000)抗体孵育，抗兔IgGFITC(1∶100)37℃孵育1h后再用小鼠抗大鼠GFAP抗体(1∶200)4℃孵育过夜，再分别用抗兔和抗鼠IgGTRITC(1∶100)37℃孵育1h后立即封片。

　　1.6 室下区细胞的分离培养 将脑损伤术后5-7d内的成年大鼠，用0.12mol/L的苯巴比妥钠经腹腔麻醉(30mg/kg)，无菌条件下暴露脑，以室下区为中心，迅速切取长约1.0-1.5cm脑组织，置入冰冷的Dhanks液中，待脑完全冷却变硬后，沿侧脑室面切取室下区，将室下区组织尽量剪成0-1mm3的组织碎屑。用巴斯德吸管将碎屑移入含有1g/L的胰蛋白酶、0.67g/L的透明质酸酶和0.1g/L DNA酶的混合酶液中，在培养箱(37℃，95% O2和5% CO2)中消化30min后，移入预先已加有等体积的1.25g/L的大豆胰酶抑制剂的离心管内，反复吹打后铜网过滤。将滤液800r/min离心5min，弃上清液。基础培养基重悬细胞，800r/min离心5min。重复5-6次后，用神经干细胞完全培养基重悬细胞，经台盼蓝实验鉴定细胞活力后，调整细胞密度为约5000-10000个/mL，种入培养瓶内悬浮培养。接种24h后换一次培养液，以后每隔7d半量换液。以上过程均在无菌间内完成。

　　1.7 单细胞悬液中细胞类型的鉴定 用巴斯德吸管吸取0.5mL的单细胞悬液接种在事先用层粘连蛋白(5ng/μL)包被的盖玻片上，37℃孵箱培养(95% O2和5% CO2)2h后，取出盖玻片，用冷的40g/L多聚甲醛固定30min，0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)反复漂洗数次后，行抗Nestin/GFAP免疫双重染色，以了解这些单细胞悬液中的细胞类型。

　　1.8 神经干细胞的自我增殖能力鉴定 培养得到的神经干细胞克隆球用机械法传代。在解剖显微镜下小心地用巴斯德吸管将细胞球尽量吹散(注意操作应轻柔)，形成单细胞悬液后移入离心管中，800r/min离心5min，弃去上清液，然后用神经干细胞培养液重悬后种入培养瓶中。

　　1.9 诱导分化实验 将培养获得的神经干细胞克隆球接种在包被有多聚赖氨酸(5ng/μL)的盖玻片上，用含有10%(体积分数)胎牛血清的神经干细胞培养液进行诱导。诱导18-24h后选择贴壁比较牢靠的干细胞和分化不同时期的盖玻片，放入40g/L多聚甲醛中固定30min。经用0.0lmol/LPBS(pH 7.4)彻底清洗后，随机分为4组：第一组行抗Nestin免疫染色;第二组行抗GFAP免疫染色;第三组行抗βtubulin III免疫染色;第四组行抗GalC免疫染色。大致步骤如下：①取细胞片与小鼠抗大鼠Nestin抗体(1∶5000)4℃孵育过夜，抗小鼠IgGFITC(1∶100)37℃孵育1h;②取细胞片与小鼠抗大鼠GFAP(1∶200)4℃孵育过夜，抗小鼠IgGTRITC(1∶100)37℃孵育1h;③取细胞片与小鼠抗大鼠βtubulin Ⅲ(1∶100)4℃孵育过夜，抗小鼠IgGTRITC(1∶100)37℃孵育1h;④取细胞片与兔抗大鼠galactocerebroside(1∶200)4℃孵育过夜，抗兔IgGFITC(1∶100)37℃孵育1h。然后用0.01mol/L PBS充分漂洗后，荧光封片剂封片后，用荧光显微镜观察。用抗体稀释液替代上述抗体处理细胞片作阴性对照。

　　1.10 对照实验 成年正常及假手术组大鼠，在无菌间内切取大致同样长度、同样部位的室下区组织后，然后如前所述获取单细胞悬液，调整细胞密度5000-10000个/mL，然后种入培养瓶内悬浮培养。

　　2 结果

　　2.1 室下区免疫组织化学染色结果 正常组及空白对照在前脑侧脑室室下区(subventricular zone, SVZ)出现神经干细胞，主要集中在外侧壁上部和上角，细胞排列较整齐，胞体较小，多为卵圆形、梭形，其突起伸向四周。侧脑室其他部位及三脑室SVZ有少量神经干细胞，但排列稀疏。脑损伤组脑损伤24h后，和正常组(图1)相比，室下区Nestin和GFAP的表达显著增加，阳性表达在3d后逐渐达到高峰，持续到1周，且用激光共聚焦显微镜观察到了荧光双标的阳性信号，即Nestin+和GFAP+共存细胞，并具有星形胶质细胞形态(图2)。随着时间的推移，阳性表达逐渐减弱，乃至消失。

　　2.2 室下区细胞分离培养、传代、诱导分化的结果 原代培养在相差显微镜下观察，可见散在分布圆形或卵圆形的单个细胞。它们大多单个存在，边缘光滑，折光度好，无细胞突起，细胞中央相当于核染色质的部位在相差显微镜下大多发暗。细胞接种3d后，在培养瓶中可发现有一些小的干细胞克隆球，在相差显微镜下仔细观察发现其由数个细胞紧密聚集而成。它们大小接近，细胞边缘光滑、中心膨隆有立体感。因而，在形态上和简单的细胞聚集有显著差别。在培养14d时，这些干细胞克隆球即已清晰可见(图3)。

　　为证实这些细胞球的确是神经干细胞克隆球，我们对它们进行了多次传代。结果获得了大量的细胞克隆球(图4)，且数目明显增多，表明这些细胞球确实是神经干细胞克隆球，并且具有极强的自我增殖能力。

　　诱导分化18h后行免疫荧光标记显示这些细胞球强烈表达神经干细胞的特征性标志物Nestin，免疫染色呈强阳性。诱导分化3d时，galactocerebroside染色结果证实这些细胞球中含有大量的galactocerebroside免疫染色阳性的细胞，形态与少突胶质细胞极为相似，但GFAP和βtubulinm III染色结果均为阴性。诱导分化5-7d左右，βtubulinm III染色结果证实这些细胞球中含有大量的βtubulinm III免疫染色阳性的细胞，并且具有神经元形态，提示它们可能是朝神经元方向定向分化的前体细胞。从干细胞克隆球内迁延出来并向周围放射状伸展的细胞中大多也为βtubulinm III染色阳性。GFAP染色结果则与βtubulinm III染色结果相类似，在荧光显微镜下观察可以看到细胞球内有很多GFAP染色阳性的胞体和细胞突起。和βtubulinIII染色结果相比，GFAP单标的细胞出现比较晚，但数目较多。从而，提示这些神经干细胞朝星型胶质细胞方向分化的速度可能要快于朝神经元的方向分化的速度。

　　图1 正常成年大鼠室下区Nestin、GFAP的表达及Nestin和GFAP的共表达(略)

　　Fig.1 Photographs showing the expression of Nestin, GFAP and the coexpression of Nestin and GFAP in normal rat subventricular zone (×200)

　　A: Nestin (green); B: GFAP (red); C: coexpression of Nestin and GFAP (yellow)

　　图2 损伤后7d室下区Nestin、GFAP的表达及Nestin和GFAP的共表达(略)

　　Fig.2 Photographs showing the expression of Nestin, GFAP and the coexpression of Nestin and GFAP in the injured brain after 7 days following injury caused by moderate lateral fluid percussion (×200)

　　A: Nestin (green); B: GFAP (red); C: coexpression of Nestin and GFAP (yellow)

　　图3 神经干细胞原代培养10d后形成神经球(略)

　　Fig.3 NSCs formed neurospheres after primary culture for 10 days (×200)

　　图4 神经干细胞次代培养14d后形成神经球(略)

　　Fig.4 NSCs formed neurospheres after secondary culture for 14 days (×200)

　　3 讨论

　　Nestin是胞浆中间丝状蛋白，属于细胞骨架的一种，可作为神经干细胞的标志蛋白，主要存在于胚胎脑组织中，在成熟大鼠和成人的某些区域也存在。大量实验证实成年脑内海马齿状回和室管膜下区存在神经干细胞[57]。GFAP是星形胶质细胞的特异蛋白和骨架成分之一，并可作为其特异性标记。Holmin等[8]利用GFAP蛋白和Nestin蛋白双标机械性脑损伤大鼠脑内的胶质细胞时发现，Nestin蛋白既可在反应性星形胶质细胞中表达，又可在非反应性星形胶质细胞中表达，且Nestin蛋白在CNS损伤的最初期就有表达，远早于GFAP蛋白。本研究结果显示，成年大鼠侧脑室SVZ区存在有神经干细胞，主要集中在外侧壁上部和上角，侧脑室其他部位及三脑室的SVZ区亦有少量神经干细胞，但排列稀疏。液压性脑损伤后神经干细胞明显表达与增殖。脑损伤24h后，和正常组相比，室下区Nestin的表达显著增加，阳性表达在3-7d后逐渐达到高峰，持续到1周。同时，用GFAP免疫单标观察到GFAP的表达变化与Nestin的表达变化极为相似。但是，Nestin稍早于GFAP蛋白。免疫荧光双标观察到部分Nestin阳性细胞与GFAP共存，根据细胞的形态学特点显示它们是星形胶质细胞及反应性胶质细胞。本结果表明，Nestin蛋白可在脑损伤后室下区正常的胶质细胞中表达，脑损伤后又可以在增生的反应性胶质细胞中表达。虽然脑损伤后诱导Nestin和GFAP大量表达的机制还不十分清楚，但该表达可能是胶质细胞对损伤的直接反应，也可能是胶质细胞对环境变化，如细胞因子、生长因子、细胞外离子和氨基酸改变的继发反应。这种损伤后不同时期Nestin和GFAP表达变化不一，也可能是神经细胞抵御损伤的继发性保护反应。损伤后反应性星形胶质细胞增生诱导Nestin表达的作用提示中枢神经系统损伤后与发育相关的基因被激活，并可能参与神经细胞的修复。

　　作为神经干细胞，根据1997年Mckay[9]在Science上发表的文章认为，就是指具有分化为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。神经祖细胞(neural progenitor cells)是相对于干细胞而言，其分化能力和自我维持、自我更新能力受到限制，仅具有单潜能或双潜能分化能力或其干细胞样特性只能维持较短的时间。

　　多分化潜能是神经干细胞的一个基本属性。在本实验的前部分，我们分离脑损伤后室下区细胞进行培养，证明了克隆细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，即多分化潜能，这与多家实验室的结果相同[1113]。为确切证明神经干细胞的多分化潜能，本实验使用单个细胞形成的克隆连续传代得到大量克隆以证实单个细胞的多分化潜能。

　　自我更新是神经干细胞的又一基本属性。所谓自我更新，指将干细胞样属性从亲代细胞传递到子代细胞，即在分裂增殖过程中子代细胞仍然维持干细胞属性[10]。本实验中分离的细胞群显然具有很强的自我更新能力，在连续传代过程中子代细胞依旧保持了亲代细胞的干细胞样属性，包括分裂增殖能力、多分化潜能和表达神经上皮干细胞蛋白。而且，这种自我更新能力维持了相当长的时间(传代>15代，时间>3M)。克隆形成实验表明1个克隆中大部分细胞不可避免死亡和分化，但仍有一部分细胞保持了干细胞样属性，表明这部分细胞实现了从亲代干细胞到子代干细胞的自我更新。

　　能不断分裂增殖是神经干细胞的重要属性。在我们的实验中成年大鼠室下区原代培养细胞及次代培养细胞具有克隆能力，在连续传代培养中依旧维持了这种克隆能力。为排除多细胞聚集产生类似集落的可能性，我们采用了单细胞克隆的方法证明单个细胞能够分裂增殖成为克隆。我们的实验结果和Reynolds等[11]的结果相同，即单细胞克隆是完全可能的。同时，我们尚使用神经上皮的特异性抗原Nestin的抗体来证明我们所分离的细胞为胚胎早期细胞，因为Nestin的表达起始于神经板的形成，在神经迁移及神经分化开始后逐渐消失[14]。因此，本实验中分离的细胞群具有自我更新能力和多分化潜能，表达神经上皮干细胞蛋白，有很强的分裂增殖能力，具备了神经干细胞的基本属性，是中枢神经系统的干细胞。

　　成体脑中神经干细胞的发现为神经发育研究和中枢神经功能重建提供了一条新的思路。从神经板的出现、神经管的形成到脑泡的发育都经历了从神经干细胞到祖细胞再到成熟神经细胞的发育过程，而神经干细胞和祖细胞的增殖、迁移与分化则无疑是其中最具代表性的环节。因此，研究神经干细胞和祖细胞的增殖、迁移和分化将为阐明神经系统发育的机制提供有力的证据[1517]。其次，神经干细胞的发现为神经退行性疾病如帕金森病的功能重建带来了希望，无论是作为脑组织移植的供体，还是作为体内诱导分化的靶细胞，神经干细胞都为中枢神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径[18]。相信随着人们对神经干细胞研究的不断深入，中枢神经系统损伤后修复的研究一定会取得突破性进展，脑瘫、脊髓损伤后截瘫等临床治疗难题也必将得到解决。

　　【参考文献】

　　[1]Doetsch F, Caille I, Lim DA, et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain [J]. Cell, 1999, 97(6):703716.

　　[2]Estivill TG, Pearson H, Van HV, et al. Pax6 is required to regulate the cell cycle and the rate of progression from symmetrical to asymmetrical division in mammalian cortical progenitors [J]. Development, 2002, 129(2):455466.

　　[3]Yagita Y, Kitagawa K, Sasaki T, et al. Differential expression of Musashi 1 and nestin in the adult rat hippocampus after ischemia [J]. J Neurosci Res, 2002, 69 (6):750756.

　　[4]张永亮，汪秉康，廖志钢，等. 大鼠侧位液压冲击脑损伤动物模型及病理学改变 [J]. 华西医科大学学报, 1999, 30(4):363367.

　　[5]Johansson CB, Svensson M, Wallstedt L, et al. Neural stem cells in the adult human brain [J]. Exp Cell Res, 1999, 253(2):733736.

　　[6]Gage FH. Mammalian neural stem cells [J]. Science, 2000, 287(5457):14331438.

　　[7]Dietrich J, Easterday MC. Developing concepts in neural stem cells [J]. Trends Neurosci, 2002, 25(3):129131.

　　[8]Holmin S, Almqvist P, Lendahl U, et al. Adult Nestinexpressing subependymal cells differentiate to astrocytes in response to brain injury [J]. Eur J Neurosci, 1997, 9(1):6575.

　　[9]Mckay R. Stem cells in the central nervous system [J]. Science, 1997, 276(5309):6671.

　　[10]Morrison SJ, Shah MN, Anderson DJ, et al. Regulatory mechanisms in stem cell biology [J]. Cell, 1997, 88(3):287298.

　　[11]Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system [J]. Science, 1992(5052), 255: 17071710.

　　[12]Davis AA, Temple S. A selfrenewing multipotenial stem cell in embryonic rat cerebral cortex [J]. Nature, 1994, 372(6503)：263266.

　　[13]Gobbel GT, Choi SJ, Beier S, et al. Longterm cultivation of multipotential neural stem cells from adult rat subependyma [J]. Brain Res, 2003, 980(2):221232.

　　[14]冬向军, 陈建国, 翟中和. 神经丝的结构与功能 [J]. 细胞生物学, 1998, 20(2):6368.

　　[15]Dasgupta B, Gutmann DH. Neurofibromin regulates neural stem cell proliferation, survival, and astroglial differentiation in vitro and in vivo [J]. J Neurosci, 2005, 25(23):55845594.

　　[16]Imitola J, Raddassi K, Park KI, et al. Directed migration of neural stem cells to sites of CNS injury by the stromal cellderived factor 1α/CXC chemokine receptor 4 pathway [J]. PNAS, 2004, 101(52):1811718122.

　　[17]Faijerson J, Tinsley RB, Aprico K, et al. Reactive astrogliosis induces astrocytic differentiation of adult neural stem/progenitor cells in vitro [J]. J Neurosci Res, 2006, 84(7):14151424.

　　[18]裴雪涛. 干细胞生物学 [M]. 北京:科学出版社, 2003:183186.