CLSM检测局灶性脑缺血NF-κB的转录活性

　　作者：毛诗贤， 杨期东 作者单位：贵阳医学院附院 神经内科， 贵州 贵阳 550004

　　【摘要】 目的： 探讨共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)结合荧光双标技术检测局灶性脑缺血nuclear factor-kappa B(NF-κB)转录活性的方法。方法： 线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注模型，给予clasto-lactacystin β-lactone抑制NF-κB的转录激活，制作石蜡切片，利用CLSM结合Fluoresceinisothiocyanate(FITC)标记NF-κB p65亚基和Propidium Iodide(PI)标记细胞核的荧光双标技术对NF-κB进行定位和定量分析。结果： 脑缺血再灌注后， NF-κB激活，CLSM显示细胞核中出现代表NF-κB的绿色荧光，NF-κB的转录活性被抑制后，细胞核中的绿色荧光减少，细胞核区绿色荧光与细胞浆区绿色荧光的比值减少。结论： CLSM结合荧光双标技术是定位、定量分析NF-κB转录活性的良好方法。

　　【关键词】 脑缺血; 再灌注损伤; 显微镜检查，聚焦; 大鼠，Sprague-Dawley; 共聚焦激光扫描显微镜; 荧光双标技术; 核因子

　　Transcriptional Activity of NF-κB Detected by Confocal Laser Scanning

　　Microscope after Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion

　　MAO Shixian1, YANG Qidong2

　　(1. Department of Neurology, The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China;

　　2.Neurology Department, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the method of detecting nuclear factor-kappa B (NF-κB) transcriptional activity by using confocal laser scanning microscope (CLSM) combined with fluorescence dual-labeling technique in a rat model of focal cerebral ischemia and reperfusion. Methods: Transient focal ischemia and reperfusion was produced by middle cerebral artery occlusion for 2 hours in Sprague-Dawley rats. The activation of NF-κB was inhibited by clasto-lactacystin β-lactone. Paraffin section was made. Quantification and location of NF-κB was analyzed by CLSM combined with fluorescence dual-labeling technique, in which NF-κB p65 subunit was marked with fluoresce in isothiocyanate (FITC) and nuclei were marked using propidium iodide (PI).Results: NF-κB was activated after focal ischemia and reperfusion. NF-κB associated green fluorescence was seen in the nuclei with CLSM. When NF-κB was inactivated, the green fluorescence in the nuclei decreased, and the ratio of green fluorescence in the nuclei and cytoplasm reduced.Conclusion: CLSM combined with fluorescence double labeling technique is a good method for location and quantitative analysis of NF-κB.

　　[Key words] brain ischemia; reperfusion injury; microscopy,confocal; rats,Sprague-Dawley; confocal laser scanning microscope; fluorescence dual-labeling technique; nuclear factor-kappa B

　　大量研究证明，脑缺血再灌注后NF-κB大量激活。通常情况下，NF-κB二聚体(常见为p65和p50 构成的异二聚体)与IκB(Inhibitor kappa B)以三聚体形式滞留于细胞浆中，呈无活性状态，细胞受刺激后，通过泛素化IκB，使其被26s蛋白酶体识别并降解，与NF-κB分离，从而释放出NF-κB进入核内，诱导相应基因的表达[1]。NF-κB的激活表现为从细胞浆移位到细胞核，故通过直接观察细胞内NF-κB 的定位，检测细胞核中的NF-κB 蛋白水平，可评价NF-κB 的活化程度。2004-2006年运用线栓法制作脑缺血再灌注大鼠模型，旨在通过CLSM结合荧光双标技术，在脑组织切片上，对脑缺血再灌注后NF-κB 进行定位、定量分析。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要材料

　　CLSM，ZEISS LSM 510，Germany。兔抗NF-κB p65特异抗体(NF-kappa B p65 epitope specific rabbit antibody)，LABVISION公司，USA。clasto-lactacystin β-lactone，ALExis公司，switzerland。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)和异硫氰酸荧光素标记的抗兔IgG (FITC-labeled affinity purified antibody to rabbit IgG)，KPL公司，UK。

　　1.2 动物分组、模型制作及灌注取材

　　健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重230～280 g，由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供。大鼠随机分为缺血组与治疗组，每组6只。相同条件下，试验分批进行，每批含各组大鼠1只。在制作 middle cerebral artery occlusion(MCAO)模型中，凡手术中动物死亡、蛛网膜下腔出血或无右侧偏瘫体征均为模型复制失败，不计在内，用同一批次的大鼠制成合格模型后补足数目。参考Nagasawa方法行左侧颈总动脉插线制作大脑中动脉缺血模型，缺血2 h后拔出线栓即形成再灌注[2]。治疗组在拔出线栓后即缺血2 h，再灌注后立即尾静脉给予clasto-lactacystin β-lactone治疗(0.03 mg/kg)。大鼠缺血2 h再灌注24 h后，用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉， 4%多聚甲醛Phosphate Buffer Solution(PBS)缓冲液灌注，断头取脑，取视交叉后2 mm脑组织层面进行脱水、透明、石蜡包埋，切片5 μm。

　　1.3 CLSM检测NF-κB 的转录活性

　　利用CLSM结合荧光双标技术对NF-κB 的活化进行定位和定量分析。碘化丙啶(PI)是一种荧光核酸染料，可与细胞核的DNA结合，用543 nm激发，在560 nm探测发出的红光荧色，指示细胞核所在。用FITC标记代表NF-κB的p65亚基，用488 nm激发，在505～530 nm探测发出的绿色荧光，可指示NF-κB在细胞中的位置。二者的波长区域不重叠, 能很好地进行区分, 这是进行双重标记和观察的基础。当2个检测器同时开通时, 可同时显示细胞中代表NF-κB的FITC和代表细胞核的PI。NF-κB为核转录因子，激活后在细胞核中发挥作用，其转录活性越强，则在细胞核中的表达越强。通过探测红色的细胞核区中代表NF-κB的绿色荧光的强弱，用细胞核区绿色荧光与细胞浆区绿色荧光的比值(F核/F胞)来定量分析，可知NF-κB转录活性的强弱，比值越大表示细胞核区中代表NF-κB的绿色荧光越强，其转录活性越大。 具体方法如下：(1) 石蜡切片脱蜡后入双蒸水5 min，2次;(2) 置0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中煮沸20 min，抗原修复，自然冷却，0.1 mol/L pH7.4 PBS液洗2 min，2次;(3) 滴加正常山羊血清工作液，室温孵育20 min;(4) 倾去血清，滴加1∶100稀释的兔抗NF-κB p65特异抗体，4 ℃孵育过夜;0.1 mol/L pH7.4 PBS液洗3 min，3次;(5) 滴加1∶50稀释的FITC标记的抗兔IgG荧光抗体(10 mg/L)，避光，37 ℃孵育30 min，0.1 mol/L PBS液洗3 min，3次，双蒸水3 min，2次;滴加PI(0.3 mg/L)，避光，37 ℃孵育20 min，0.1 mol/L PBS液洗3 min，3次，双蒸水3 min，2次;(6) 滴加甘油缓冲液，封片，CLSM检测。

　　CLSM检测：将切片置于CLSM的载物台上，选用40倍物镜，氩、氦、氖离子激光器做为光源，同时发射488 nm和543 nm激光，分别激发FITC 和PI ，光电倍增管1(PMT1)选择560 nm的发射滤光片，探测PI的红色荧光;光电倍增管2(PMT2)选择505～530 nm的发射滤光片，探测FITC的绿色荧光。

　　1.4 统计方法

　　所有数据以x±s表示，应用SPSS10.0统计软件进行t检验，检验水准为α=0.05。

　　2 结果

　　实验结果显示：在缺血组，脑缺血再灌注后 NF-κB激活，CLSM检测显示细胞核中出现代表NF-κB的绿色荧光，F核/F胞为1.27±0.26;在治疗组，给予clasto-lactacystin β-lactone，它通过抑制26s蛋白酶体活性而阻断IκB的降解，从而抑制NF-κB的转录活性(实验数据未显示)[3]。 CLSM显示细胞核中的绿色荧光减少，F核/F胞为0.53±0.18，细胞核区绿色荧光与细胞浆区绿色荧光的比值(F核/F胞)较缺血组减少，两组间比较P<0.01。

　　CLSM下见双重标记的大鼠脑组织切片荧光图像: PMT1显示PI标记的细胞核区，呈红色荧光图像 ( 图1a 、2a)， 清楚地显示了细胞核的外形轮廓。PMT2显示代表p65蛋白的绿色荧光图像(图1b、2b)，治疗组细胞核区中的绿色荧光减少，绿色荧光主要分布在细胞浆(图2b),合成2种荧光图像,细胞核为红色,细胞浆为绿色(图2c)，而缺血组显示整个细胞为绿色荧光图像(图1b)，绿色荧光主要分布在细胞核，合成图像显示红色荧光的细胞核区中绿色荧光强度明显高于治疗组(图1c) 。

　　3 讨论

　　随着脑缺血病理生理机制研究的进展，目前认为脑缺血再灌注后的炎症级联反应是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一。脑缺血再灌注后NF-κB被大量激活，激活的NF-κB移位入细胞核，转录调节多种细胞因子和炎症介质，被认为是炎症级联反应的中心靶点。故对NF-κB转录活性的研究成为脑缺血再灌注损伤研究的热点。

　　自CLSM问世后，已广泛用于神经科学的研究中，国外学者已把它成功用于NF-κB、p53等转录因子的研究[4，5]。与普通荧光显微镜相比，CLSM提高了敏感性、分辨率及清晰度，能同时显示几种标记物，并能对同一标本中不同荧光标记的不同物质进行精确的定位、定量研究。

　　CLSM可直接观察转录因子的转录活性，但多用于细胞的观察，而用于脑组织切片观察NF-κB的转录活性研究很少。在实验中我们成功地把它用于脑组织切片上观察NF-κB的转录活性。

　　本实验用FITC 标记代表NF-κB 的p65亚基， PI标记细胞核区，通过制作脑缺血再灌注模型刺激 NF-κB的激活，CLSM显示红色的细胞核区中出现代表NF-κB的绿色荧光;在治疗组，给予clasto-lactacystin β-lactone后，NF-κB的转录活性被抑制，CLSM显示代表NF-κB的绿色荧光主要分布在细胞浆中，细胞核区中的绿色荧光减少，F核/F胞减少，两组比较P<0.01，具有统计学意义。用FITC 标记NF-κB ， PI 标记细胞核，应用CLSM不仅能从形态定位上直接观察脑缺血再灌注后NF-κB 的活性状态，同时还可通过测定荧光的强度间接反映NF-κB 的活性强度。CLSM结合荧光双标技术对NF-κB进行定位定量、分析，为NF-κB转录活性的研究提供了一个很好的方法。

　　【参考文献】

　　[1] Amir RE, Iwai K, Ciechanover A. The NEDD8 pathway is essential for SCF (beta-TrCP)-mediated ubiquitination and processing of the NF-kappaB precursor p105[J]. Journal of Biological Chemistry,2002(26):23253-23259.

　　[2] Nagasawa H,Kogure K. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion [J].Stroke,1989(8):1037-1043.

　　[3] Dick LR,Cruikshank AA,Grenier L,et al.Mechanistic studies on the inactivation of the proteasome by lactacystin:a central role for clasto-lactacystin beta-lactone[J].J Biol Chem,1996(13):7273-7276.

　　[4] Deptala A, Bedner E, Gorczyca W,et al. Activation of nuclear factor kappa B (NF-kappaB) assayed by laser scanning cytometry (LSC)[J].Cytometry, 1998(3):376-382.

　　[5] Grace MJ, Xie L, Musco ML,et al. The use of laser scanning cytometry to assess depth of penetration of adenovirus p53 gene therapy in human xenograft biopsies[J].American Journal of Pathology，1999(6):1869-1878.