大脑前动脉穿刺法制作蛛网膜下腔出血大鼠模型

　　作者：王宝忠 李刚 作者单位：建昌县康复医院神经外科，辽宁 建昌 125300

　　【摘要】 目的 应用穿刺法制作蛛网膜下腔出血(SAH)动物模型,为SAH的实验研究提供简单、可靠的模型制作方法。方法 以SD大鼠为实验动物,将动物分为正常对照组、假手术组和模型组。显微手术分离大鼠左颈部动脉,使用锐化尼龙线经颈外动脉进入颈内动脉至颅内,穿刺大脑前动脉形成SAH。假手术组仅分离颈部动脉不实施穿刺。测定各组2 h内局部脑血流量(rCBF),3 d后用DAB染色法显示大鼠额区微血管,测定微血管直径、密度(MVD)、微血管面积比(MVA)。结果 模型组大鼠颅脑解剖发现蛛网膜下腔内大量的血液和血凝块,术后2 h内rCBF显著降低,3 d后模型组大鼠额区微血管直径、MVD、MVA明显下降。结论 应用大脑前动穿刺法成功建立了简单、可靠、接近于临床的大鼠SAH模型。

　　【关键词】 蛛网膜下腔出血 动物模型 穿刺

　　蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种常见的出血性脑血管疾病,常继发于动脉瘤破裂出血,居于脑血管意外的第三位,仅次于脑血栓形成及高血压脑出血,其死亡率及致残率较高[1,2]。建立一种简单、稳定、可靠的SAH动物模型来研究SAH后的病理生理变化,对于指导临床治疗具有重要的意义[3]。本研究采用大脑前动脉刺穿法建立大鼠SAH模型,通过测定局部脑血流量(rCBF),微血管直径、密度(MVD),微血管面积比(MVA)验证模型的可靠性,为进一步研究SAH发病与治疗提供简单、可靠的动物模型制作方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　SD大鼠雌雄各半,3～4月龄,体重300～350 g,由辽宁医学院实验动物中心提供。大鼠随机分为3 组:正常对照组10 只,不给予任何处理因素;假手术组10 只,仅显微手术分离颈部动脉;模型组10 只, 显微手术分离颈部动脉,穿刺法制作SAH模型。

　　1.1.2 试剂和仪器

　　DBA显色试剂盒(美国Santa Cruz公司);立体定位仪(Narishige, Tokyo, Japan),K90牙科台式电钻车(浙江宁波医疗器械厂);激光多普勒血流计(Perimed,瑞典);倒置式生物显微镜(日本奥林巴斯公司), YD-2800型恒温恒冷切片机(上海华岩仪器设备有限公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 蛛网膜下腔出血模型的建立

　　10%水合氯醛麻醉大鼠(300 mg/kg),立体定向仪固定头部,取颈部正中切口切开皮肤,在显微镜下暴露左侧颈总动脉(CCA)主干及分叉处,显露左侧颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA),分离颈外动脉近分叉处分支,包括甲状腺上动脉和咽升动脉等,用双极电凝器电凝离断,电凝翼腭动脉,于ECA远心端结扎并剪断,拉直ECA使其与ICA成一直线。将3-0单丝尼龙线(长约5 cm,前端用手术刀片切成斜面)经ECA导入ICA,用显微手术镊将进入颈内动脉的尼龙线继续插入,当进至翼腭动脉超始部时,轻抬颈外动脉使此处的弯曲消失,以利尼龙线顺利通过。向远端继续插入尼龙线至颈内动脉颅内段,有阻力感后再插入2 mm左右刺破willis环,造成蛛网膜下腔出血,迅速将尼龙线拔出,整个过程不超过30 s。假手术组除不刺破血管外,其余操作与前两组相同。

　　1.2.2 局部脑血流量检测

　　穿刺手术前大鼠俯卧固定,取颅顶正中切口,于冠状缝旁5 mm处电钻钻1个直径约3 mm的平底小孔, 用另一立体定向仪的微操纵臂将激光多普勒血流计(LDF),LDF探头垂直置放于硬脑膜上,LDF探头与LDF血流仪相连,通过微机屏幕连续记录前后前脑局部脑血流量(rCBF)。LDF探头经固定得到合适的rCBF信号,在整个实验过程中保持探头的位置和深度不变。

　　1.2.3 脑微血管染色和微血管定量分析

　　造模后3 d快速断头处死大鼠,取额区(region frontalis)脑组织,10%中性甲醛液固定12 h后,蔗糖梯度脱水,连续冰冻切片,片厚50 μm,用涂有铬矾明胶的载玻片贴片。每只大鼠取6张切片,采用DAB法染色后常规晾干、脱水、固定、封片。每张切片在倒置显微镜200倍下拍照额区微血管5个视野,用Image-proplus图像分析软件分析每个视野下的微血管直径、微血管个数和微血管面积,并以单位面积内的微血管数目和面积作为MVD、MVA。每只大鼠取6张切片计算平均值。

　　1.2.4 统计学处理

　　数据以均值±标准差(±s)表示,应用SPSS12.0软件系统分析,应用方差分析及q检验进行统计学处理。

　　2 结 果

　　2.1 模型验证

　　造模3 d后处死各组大鼠行颅脑解剖观察,见造模组大鼠蛛网膜下腔中有弥漫分布的血液及血凝块,主要分布于前颅窝、蝶鞍处及后颅窝,覆盖脑底部的主要血管,对照组和假手术组未发现SAH现象,所有动物均未发现脑实质的出血或机械损伤。

　　2.2 局部脑血流量变化

　　正常对照组和假手术组在穿刺后rCBF无明显变化。造模组在穿刺后rCBF即显著下降,穿刺后10 min时达术前值的45.12%,在穿刺后20 min时达术前的35.74%,随后rCBF呈缓慢回升的趋势,整个观察时间内维持在低水平,至穿刺结束后2 h,为术前值的44.53%,各时点的均显著低于假手术组和对照组(P<0.05,图1)。图1 各组大鼠局部脑血流量改变2.3 SAH后脑微血管的变化

　　造模后3 d对各组大鼠行颅脑解剖,模型组大鼠DAB染色后额区脑血管呈棕黑色,额区MVD、MVA与正常组对照组及假手术组相比均显著下降(表1)。表1 额区微血管染色图像分析注：*与正常组及假手术比较P<0.05

　　3 讨 论

　　目前制造蛛网膜下腔出血模型一般采用两种方式[4]:一是将自体动脉血直接注入蛛网膜下腔;二是刺破颈内动脉颅内段某一部位,使血液自动流入蛛网膜下腔。第一种方式操作复杂不易掌握,且需要开颅,容易对动物的大脑造成损伤[5]。本研究采用大脑前动脉血管穿刺法建立的大鼠模型,避免了以往穿刺法制作模型需要暂时阻断颈总动脉,可能引起短暂局部脑缺血的不足。主要有以下几方面优点:(1)手术简单、可靠,操作主要在颈部,非开颅方法,手术创伤小;(2)出血时有动脉壁的损伤及血管内膜与脑组织的接触,考虑了血管内膜分泌的血管活性物质对脑组织的损害作用;(3)模拟了动脉瘤破裂时血流对脑组织的直接冲击作用;(4)临床上前循环动脉瘤发生率较高,经颈内动脉刺破willis环造成SAH发生于密闭的颅腔中,出血时造成颅内压突然持续上升,与人类动脉瘤破裂后SAH时颅内压的升高的实际情况类似,可供颅内动脉瘤皮裂出血所致的病理生理状态的研究[6]。

　　本实验监测结果表明,该模型动物发生了脑血液灌流量持续下降,与文献[7]报道一致,说明成功诱导了SAH后继发性脑缺血。应用染色法显示大鼠额区微血管直径在3 d后无明显变化,而出现微血管数量及面积的减少,分析结果可能是由于颅底大血管痉挛造成低灌注状态下毛细血管开放数量减少所致[8]。本实验建立的改良大鼠蛛网膜下腔出血模型对大鼠的创伤小,手术操作简单,能够产生明显的血液流变学和脑微血管的变化,与导致的病理生理状态较为相近,适用于治疗SAH方法疗效的观察及SAH后的病理生理机制的研究。

　　【参考文献】

　　[1] González-Pérez MI. Results of treatment of subarachnoid haemorrhage due to a ruptured cerebral aneurysm [J]. Neurocirugia, 2006, 17:433-439.

　　[2] Nishizawa S, Zhang JH. Basic research and treatment for cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage: the present and future prospects [J]. No Shinkei Geka, 2008, 36(2):121-133.

　　[3] Sugawara T, Ayer R, Jadhav V, et al. A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model [J]. J Neurosci Methods, 2008, 167(2):327-334.

　　[4] 金清东,陈志.蛛网膜下腔出血动物模型的研究进展[J].现代医药卫生, 2007, 23(12):1803-1804.

　　[5] 李了了,王玲,冯楠,等.一种简单可靠的大鼠蛛网膜下腔出血模型的建立[J]. 药学学报, 2005,40(12):1096-1098.

　　[6] Veelken JA, Laing RJ, Jakubowski J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats [J]. Stroke, 1995, 26(7):1279-1283.

　　[7] Bederson JB, Germano IM, Guarino L. Cortical Blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat [J]. Stroke, 1995, 26(6):1086-1092.

　　[8] 朱庆,刘艳霞,李刚,等.改良大鼠蛛网膜下腔出血模型[J].中国药理学通报, 2006, 22(9):1144-1146.