家兔上矢状窦中1/3及其回流静脉结扎动物模型的建立

　　作者：唐忠 袁贤瑞 粟 枫 作者单位：中南大学湘雅医院神经外科， 湖南 长沙 410008

　　【摘要】 目的 建立一种新的上矢状窦中1/3及其回流静脉结扎的家兔动物模型，为上矢状窦的外科研究提供实验基础。 方法 显微镜下暴露兔脑上矢状窦中1/3，用9-0无损伤显微缝合线结扎，同时结扎矢状窦两侧直径> 0.8 mm的所有回流静脉。术后观察动物行为及脑组织病理变化，测定脑组织含水量。 结果 上矢状窦中1/3及其回流静脉结扎可引起家兔偏瘫、肌张力减低等神经功能障碍，但大多能长期存活。结扎后主要病理改变：神经元变性，神经细胞与胶质细胞水肿，线粒体结构模糊，内质网扩张及窦旁皮质组织水肿;均能逐渐恢复。 结论 家兔上矢状窦中1/3及其回流静脉结扎模型操作简单，易控制，稳定，重复性较好，病死率低，是比较理想的研究上矢状窦结扎的实验模型。

　　【关键词】 模型 动物 上矢状窦中1/3 结扎术 兔

　　Ligation of the middle third of the superior sagittal sinus and its veins in rabbits for establishment of model

　　TANG Zhong, YUAN Xianrui, SU Feng, et al

　　Department of Neurosurgery, Xiangya Hospital, Center-South University, Changsha 410008, China

　　Abstract: Objective To establish a new model by ligating the middle third of the superior sagittal sinus and its veins in rabbits for offering an experimental base for surgery of the superior sagittal sinus. Methods The middle third of the superior sagittal sinus in rabbit was exposed enough under the microscope, ligated with 9-0 non-injured suture line, and all the veins with a diameter over 0.8 mm were ligated. The changes of behavior and histopathology of the brain tissue were evaluated in all the experimental animals, and the water content of the brain tissue was detected. Results Most of the rabbits can live for a long-term after the middle third of the superior sagittal sinus and its veins ligation with symptoms and signs of neural system such as hemiplegia and hypomyotonia. The histopathological changes of brain tissue include neuronal degeneration, edema of nerve cell and gliacyte, the obfuscation of chondriosome structure, dilation of endoplasmic reticulum and brain edema of the cerebral cortex, which can gradually recover. Conclusion The rabbit model of ligating the middle third of the superior sagittal sinus and its veins is stable, easily established and controlled with good reproducibility and low death rate, thus being ideal for studying the superior sagittal sinus.

　　Key words: animal model; middle third of the superior sagittal sinus; occlusion; rabbit 既往认为上矢状窦 (SSS) 中1/3结扎或闭塞可能造成极其严重的后果，如昏迷、偏瘫甚至死亡，而我们发现在SSS旁中1/3脑膜瘤术中被迫将SSS中1/3结扎后，病人虽出现偏瘫等神经功能障碍，但基本可于3个月内逐渐恢复。为此，我们采用家兔为实验动物，在显微镜下结扎SSS中1/3及其回流静脉，首次建立家兔SSS中1/3及其回流静脉结扎动物模型，为手术结扎SSS，及对SSS旁中1/3脑膜瘤、SSS中1/3损伤的治疗研究提供实验研究基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 成年健康中国家兔 (清洁级) 52只，雌雄不限，体质量1.5~2 kg，均购自中南大学动物中心，术前伺养20 d以适应环境。随机分为7组：假手术对照组7只，仅行开颅，不作结扎;SSS中1/3及其回流静脉结扎6组，其中结扎后4 h组、8 h组、12 h组、24 h组、72 h组各7只，长期组 (90 d组) 10只。

　　1.2 SSS中1/3及其回流静脉结扎动物模型制作方法 家兔术前晚控制饮食，术晨禁食、水。经兔耳缘静脉按30 mg/kg注入3%戊巴比妥钠行全身麻醉，俯卧位固定于专用兔手术台上，用保温毯维持肛温于38~39 ℃，保持兔呼吸道通畅。头垫于圈垫上，上颌齿用细绳向前方牵拉并固定，使动物头部伸展。于颅顶正中作一纵行直切口，前达额骨，后至顶间骨前缘，长约4 cm，皮瓣向左右两侧牵开，暴露颅骨。在手术显微镜下操作，于冠状缝后与矢状缝间左侧顶骨钻孔，将其扩大成2.0 cm × 1.2 cm大小骨窗，骨窗位于冠状缝与人字缝之间，保持硬脑膜完整，并充分暴露SSS中1/3。术中仔细操作，避免损伤其他脑组织。硬膜外彻底止血，参照Liebetrau等[1]的方法并加以改进，用9-0无损伤显微缝合线分别于冠状缝后3 mm、人字缝前3 mm结扎SSS，继而将SSS左右两侧直径>0.8 mm的所有回流静脉紧靠SSS处予以仔细结扎，至显微镜下见SSS中1/3及回流静脉结扎处静脉窦及静脉颜色变白，确定结扎可靠。止血满意后逐层缝合伤口。

　　1.3 动物观察 结扎后随时观察动物的反应和行为学改变，动物清醒后送动物房分笼饲养，并随时观察其全身情况，记录神经功能改变 (偏瘫、抽搐、昏迷等)。

　　1.4 脑组织病理形态学检查 各组动物于相应时间段用过量戊巴比妥钠注射处死，断头后迅速开颅取SSS中1/3旁脑皮质组织，切成1 cm × 2 cm小块，4%多聚甲醛 (0.1 mol/L磷酸缓冲液pH7.4配制) 浸泡固定4 h，置于30%蔗糖溶液中至标本下沉。20 μm连续切片，进行苏木精-伊红染色，光镜下观察。每组各取2只动物，迅速取SSS中1/3旁脑皮质组织约0.05 g，经2.5%戊二醛固定，常规制作电镜标本，电镜下观察。

　　1.5 脑组织含水量测定 将不同时间段取出的脑组织放在内有0.5 ml生理盐水定性滤纸的培养皿中，以防水分蒸发。去除皮质表面的软脑膜，取SSS中1/3窦旁脑0.2~0.3 g左右的脑皮质组织置于称量杯中称重 (从开始取脑至第1次称重完毕控制在5 min内)。放入电热恒温干燥箱内105 ℃ 24 h，至恒重后称干重 (2次干重之差≤0.2 mg)。根据Elliott公式计算脑组织含水量：脑组织含水量 (%)=(湿重-干重) /湿重 × 100%。采用SPSS10.0软件进行方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 结扎后动物反应 结扎后4 h组、8 h组、12 h组各7只动物精神差，反应迟钝。结扎后24 h组精神差6只，精神一般1只;进食一般6只，进食困难1只;均反应迟钝;四肢瘫4只，四肢轻瘫1只，偏瘫2只，肌张力均减低。结扎后72 h组精神差5只，精神一般2只;进食一般6只，进食困难1只;均反应迟钝;四肢瘫3只，四肢轻瘫1只，偏瘫3只，肌张力均减低。长期组 (90 d组) 动物3 d内反应及神经症状与72 h组相同，90 d后恢复正常9只;1只结扎后精神极差，进食困难，四肢瘫，于第4天死亡。

　　2.2 SSS中1/3窦旁脑皮质组织的形态学观察

　　2.2.1 光镜观察 (图1~4)： 假手术对照组的窦旁脑皮质组织神经元、胶质细胞结构正常，血管及间质无充血、水肿;实验组脑组织水肿明显，神经元变性，表现为核固缩，部分细胞致密、深染，突起消失，血管间隙增宽，可见血管扩张。这些改变从结扎后4 h组即可观察到，以结扎后8 h组最为明显，结扎后12 h组、24 h组、72 h组逐渐好转，长期组 (90 d组) 神经元、胶质细胞、血管各结构基本接近正常。

　　2.2.2 电镜观察 (图5~8)： 假手术对照组超微结构无异常改变，组织结构正常，神经细胞及胶质细胞无水肿，细胞质内线粒体及内质网结构清晰，核膜清晰。结扎后4 h组绝大多数神经细胞及胶质细胞水肿，线粒体结构模糊，部分嵴丢失而呈空泡变，部分内质网轻度扩张;结扎后8 h组多数神经细胞及胶质细胞水肿严重，细胞质内出现大的空泡，线粒体结构模糊，内质网扩张，核膜较模糊;结扎后12 h组见局灶水肿，胶质细胞水肿，神经细胞的细胞质内线粒体及内质网结构模糊，核膜结构不清晰;结扎后24 h组见局灶水肿，其病理超微结构改变较12 h组轻，部分线粒体及内质网结构较清楚;结扎后72 h组病理改变较24 h组轻，仅胶质细胞水肿;长期组 (90 d组) 多数神经细胞的细胞质内大多数线粒体及内质网结构清楚，胶质细胞未见水肿，仅见个别神经细胞轻度水肿。

　　2.3 SSS中1/3窦旁脑皮质组织含水量改变 家兔SSS中1/3及其回流静脉结扎后4 h、8 h、12 h、24 h、72 h、长期组 (90 d组) 窦旁皮质组织含水量分别为 (80.38 ± 0.31)%、(80.92 ± 0.56)%、(79.86 ± 0.44)%、(79.54 ± 0.38)%、(78.32 ± 0.50)%、(78.11 ± 0.38)%，假手术对照组为 (77.90 ± 0.25)%。与假手术对照组比较，结扎后4 h、8 h、12 h、24 h组窦旁皮质组织含水量显著性增高 (P < 0.05)，结扎后72 h组、长期组 (90 d组) 无显著性差异 (P > 0.05)。说明水肿从4 h开始，到8 h达到高峰，以后水肿逐渐减轻。

　　3 讨 论

　　本实验首次采用家兔建立SSS中1/3及其回流静脉结扎的动物模型，国内外尚未见报道。此模型的建立在手术显微镜下操作，术中保持恒温，用9-0无损伤显微缝合线结扎SSS中1/3及其回流静脉，对脑组织损伤小，减少了干扰因素对兔与兔脑的影响，接近于临床实际，可观察结扎对脑组织的影响。通过显微镜下辨认SSS及其回流静脉颜色变白以确认结扎牢固可靠，方法简便、准确。本模型操作简单，易控制，重复性较好。由于大鼠具有脑血管解剖近似人类，血管性损伤恒定，重复性好等优点，是制作SSS闭塞的常用动物模型。但由于本模型模拟外科结扎，鼠脑SSS及其回流静脉因太小而不便操作，有创性操作可能会对大脑产生较大影响，因此我们采用家兔，其血管与犬和猫等相比更接近灵长类[2]。

　　目前国内对SSS结扎的研究不多，尤其对SSS中1/3的研究尚未见报道。张思迅等[3]应用大鼠SSS后1/3结扎模型，对其回流区组织的影响进行了研究。国外学者对SSS闭塞进行了一系列研究，对SSS单纯结扎也有报道，但对SSS加回流静脉结扎的研究尚未见报道。SSS中1/3结扎后，根据Oka等[4]及徐子明等[5]的研究，大脑半球的浅静脉、脑膜静脉等即成为逆向流出通道，大脑的表浅静脉依其流向分为四组，其中上矢状组流向上矢状窦，因此血液有可能从上矢状窦一侧的回流静脉通过上矢状窦而流向另一侧的回流静脉;另外，单纯SSS中1/3结扎时，两侧回流静脉可以形成不同代偿通道，皮质静脉增粗，及端端吻合等，从而减轻窦旁皮质的缺血、缺氧等情况。预实验中我们对家兔行单纯SSS中1/3结扎，发现虽对家兔有一定程度的影响，如轻度高颅压、脑水肿等，但不致于造成家兔偏瘫。因此，本实验对家兔作SSS中1/3及其回流静脉结扎，以确保阻断血液流入SSS中1/3。

　　文献报道的SSS闭塞动物模型，多倾向于神经内科研究，如将SSS前后结扎后向窦腔内缓慢注射血栓形成因子，制成窦及回流静脉闭塞模型，以研究静脉窦及回流静脉栓塞问题。本研究建立的动物模型制作方法不同，目的与临床应用亦不同，是从神经外科角度出发，行SSS中1/3及其回流静脉结扎，为今后手术结扎SSS、SSS旁中1/3脑膜瘤及SSS中1/3损伤的治疗研究提供动物模型。

　　本实验观察到SSS中1/3及其回流静脉结扎后，家兔可长期存活，仅死亡1只;能引起家兔精神差、反应迟钝，且引致偏瘫、肌张力减低等神经学症状，但这些症状于结扎3 d后均逐渐恢复正常。实验结果与大多数学者认为的SSS中1/3不能结扎观点不同，首次证实并说明动物家兔SSS中1/3及其回流静脉可以结扎，且引起的神经功能障碍可逐渐恢复;其原因可能是结扎后侧支循环开放，使静脉回流得以重建。光镜与电镜结果显示：结扎后神经元变性，有核固缩，血管扩张;神经细胞与胶质细胞水肿，线粒体结构模糊，内质网扩张。这些病理超微结构改变于3 d后基本恢复正常，90 d时接近正常。本实验结果显示：结扎后4 h窦旁皮质组织开始出现水肿，8 h左右达到高峰，结扎后12 h、24 h、72 h、长期组依次减轻，长期组脑水肿接近假手术对照组。SSS中1/3及其回流静脉结扎后引起脑水肿的机制：静脉结扎导致血栓形成，而血栓发展影响静脉回流，加上回流静脉已结扎，血液淤积于静脉系统和毛细血管内，静脉压升高，在静水压的驱动下，游离水分经毛细血管床进入脑实质和脑室，脑脊液回流受阻，动脉血流减慢，脑组织缺血、缺氧，从而引起脑水肿。由于其后静水压增高后侧支循环开放，静脉回流得以重建，因此，窦旁皮质组织水肿随时间延长而逐渐减轻，至90 d时已趋于正常。

　　【参考文献】

　　[1] Liebetrau M, Gabriejcic-Geiger D, Meyer P, et al. Increased calpain expression following experimental cerebral venous thrombosis in rats [J]. Thromb Res, 2003; 112(4): 239-243.

　　[2] Hossmann KA, Schuier FJ. Experimental brain infarcts in cats. Ⅰ. Pathophysiological observations [J]. Stroke, 1980; 11(6): 583-592.

　　[3] 张思迅, 左焕琮. 大鼠上矢状窦后1/3夹闭对其回流区组织的影响——自由基、脑水肿及病理改变 [J]. 中华创伤杂志, 1995; 11(4): 219-220.

　　[4] Oka K, Go Y, Kimura h, et al. Obstruction of the superior sagittal sinus caused by parasagittal meningiomas: the role of the collateral venous pathways [J]. J Neurosurg, 1994; 81(4): 520-524.

　　[5] 徐子明, 余新光, 宋志惠, 等. 上矢状窦中后部脑膜瘤导致静脉窦闭塞后静脉代偿特点及意义 [J]. 中华神经外科杂志, 2003; 19(3): 170-173.