树突状细胞诱导的CTLs与CIK及LAK细胞对神经胶质瘤杀伤作用比较

　　作者：宫安静 孟庆海 朱湘华 作者单位：青岛大学医学院附属医院神经外科，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 比较树突状细胞(DCs)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)和淋巴细胞因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)对神经胶质瘤的体外杀伤作用。方法 向外周血单个核细胞分别加入不同细胞因子组合，诱导出DCs、CIK细胞和LAK细胞，DCs负载胶质瘤抗原后激活CTLs，MTT法检测对胶质瘤细胞的体外杀伤效应。结果 CTLs对胶质瘤细胞的杀伤作用明显强于CIK细胞和LAK细胞(F=6.42～8.26，q=8.02～10.18,P<0.01);CIK细胞对胶质瘤的杀伤作用明显强于LAK细胞(q=8.43～9.24,P<0.01)。CIK细胞对K562细胞的杀伤作用明显强于LAK细胞和CTLs(F=5.36～7.69，q=7.23～9.56,P<0.01)，LAK细胞对K562细胞的杀伤作用明显强于CTLs(q=8.83～9.15,P<0.01)。结论 从人外周血中诱导出的DCs负载胶质瘤抗原后，激活的CTLs在体外对胶质瘤细胞能产生高效而特异的杀伤作用，明显强于CIK细胞和LAK细胞，为临床应用DCs瘤苗奠定基础。

　　【关键词】 树突细胞 杀伤细胞 神经胶质瘤 免疫学试验

　　CONTRAST AMONG ANTITUMOR EFFICACY OF LAK, CIK AND CTLs ACTIVATED BY DENDRITIC CELLS GONG ANJING， MENG QINGHAI， ZHU XIANGHUA(Department of Neurosurgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo contrast the antitumor efficacy among LAK, CIK and CTLs activated by dendritic cells in vitro. MethodsPeripheral blood monocytes were induced to DCs, CIK and LAK by different kinds of cytokine. After being pulsed in vitro with glioma lysates, DCs were used to induce T lymphocytes into cytotoxic T lymphocytes for glioma cells. The cytotoxicity was assayed by MTT.ResultsCTLs were stronger than CIKs and LAKs in killing glioma cells (F=6.42-8.26，q=8.02-10.18,P<0.01). CIK was stronger than LAK, as well as LAK and CTLs in killing K562 and glioma cells, respectively (q=8.43-9.24,P<0.01) (F=5.36-7.69，q=7.23-9.56,P<0.01). LAK killed more K562 cells than CTLs did (q=8.83-9.15,P<0.01).ConclusionThe antigen specific CTLs can kill glioma cells effectively and specifically ,which might play a great role in clinical therapy.

　　[KEY WORDS]dendritic cells; killer cells; glioma; immunologic tests

　　胶质瘤是中枢神经系统内最常见的恶性肿瘤，由于呈浸润性生长,手术难以切除干净，复发率高，化疗、放疗等其他常规治疗效果都不甚理想。近来发现，免疫治疗对胶质瘤有较好的疗效。目前研究较多的有淋巴细胞因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)及树突状细胞(DCs)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。本文比较了上述三种杀伤细胞对神经胶质瘤的体外杀伤作用，并对其可能的机制进行了探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂

　　rhGMCSF、rhIL4及rhTNFα等试剂均购自STRATHMANN BIOTECH GMBH，PE标记鼠抗人CD1a、CD80、CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD56、CD83、CD86、HLADR单抗及鼠IgG1PE购自IMMUNOTECH,COULTER公司，RPMI 1640购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品有限公司，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂，MTT、二甲基亚砜购自SIGMA公司，IL2、IL1、CD3McAb、γIFN等试剂购自北京邦定生物制品有限公司。

　　1.2 标本来源

　　神经胶质瘤来源于青岛大学医学院附属医院神经外科2003年1～12月经病理诊断为胶质瘤的病人，共20例，男女各10例;年龄10～65岁，平均47岁;其中Ⅰ级4例，Ⅰ～Ⅱ级2例，Ⅱ级4例，Ⅲ级5 例，Ⅳ级5例。K562白血病细胞由中科院惠赠。

　　1.3 细胞制备

　　1.3.1 LAK细胞的制备 取病人外周静脉血，用肝素抗凝，淋巴细胞分离液水平离心机梯度离心(2 000 r/min,20 min)，吸取界面白膜层细胞，即为外周血单个核细胞(PBMC)，接种于24孔板，加入含体积分数0.10的FCS、106 U/L IL2的RPMI 1640培养液培养，每隔3 d换液，第6天收获细胞。

　　1.3.2 CIK细胞的制备 外周血PBMC接种于24孔板，加入γIFN 106 U/L，24 h后加入5×105 U/L IL1及IL2，100 μg/L CD3 McAb，隔天换液，补充IL2，剂量同前。第14天收获细胞。

　　1.3.3 DCs的诱导及CTLs的制备 分离外周血PBMC，加入24孔培养板，每孔1 mL,在37 ℃体积分数为0.05 CO2的饱和湿度培养箱内贴壁2 h，除去非贴壁细胞，用含rhGMCSF(106 U/L)、rhIL4(106 U/L)和体积分数为0.10 FCS的RPMI 1640培养液培养贴壁细胞，每3 d半量换液并补充新鲜细胞因子，第7天加入50 μg/L rhTNFα，第10天收获DCs。

　　将原代培养的胶质瘤细胞用培养液悬浮成浓度为5×109/L的细胞悬液，在-80 ℃冷冻2 min，37 ℃水中溶解4 min，反复4～5次，裂解物离心(8 000 r/min,20 min)收集上清，0.2 μm滤器过滤，肿瘤抗原与DCs以3∶1比例混合培养18 h，收集DCs,即为胶质瘤细胞抗原致敏的DCs。负载胶质瘤细胞抗原的DCs与淋巴细胞按1∶10混合培养3 d,即得针对神经胶质瘤细胞特异性CTLs。

　　1.4 免疫表型测定

　　收集培养细胞，用PBS洗涤1次，悬浮为2×109/L，每管100 μL加入离心管，加入单抗，4 ℃避光标记30 min,PBS洗2次，流式细胞仪检测。

　　1.5 体外杀伤实验

　　分别设立胶质瘤细胞实验组和K562细胞对照组，CTLs、CIK及LAK细胞为效应细胞，胶质瘤细胞和K562细胞为靶细胞，并分别设立效应细胞和靶细胞平行对照孔，培养液调靶细胞浓度为1×107/L，效应细胞浓度分4组：1×108/L、2×108/L、4×108/L、8×108/L，即效靶比为10∶1、20∶1、40∶1、80∶1，每种浓度设3个复孔，每孔效靶细胞各100 μL,总体积200 μL。细胞混匀，在37 ℃体积分数0.05 CO2的饱和湿度下培养48 h,实验终止前4 h每孔加入新鲜配制的5 g/L的MTT 20 μL，离心(1 500 r/min,5 min)去上清液，每孔加入分析纯DMSO 150 μL,振荡溶解5 min,于酶标仪上570 nm处读取A值，按下列公式计算杀伤率：杀伤率=[A1-(A3-A2)]/A1×100%。其中A1为靶细胞吸光度值，A2为效应细胞吸光度值，A3为效靶细胞杀伤反应后的吸光度值。

　　1.6 统计学处理

　　数据用±s表示，组间比较采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 形态学观察

　　DCs从培养第2天起，细胞形态出现不规则改变，周边可见少量突起。第7天加入rhTNFα后，细胞体积增大，胞内颗粒增粗，颜色加深，从胞体周围伸出多个长短不一的树枝状突起。CIK细胞与LAK细胞诱导后细胞数量增多，体积明显增大，胞核密度加深，可见大量颗粒。

　　2.2 免疫表型测定

　　DCs高表达CD1a、CD80、CD83、CD86、HLADR;CIK细胞表面分子CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD56表达显著升高，尤以CD3、CD56增高明显。

　　2.3 对脑胶质瘤的体外杀伤作用

　　CTLs对胶质瘤的杀伤作用明显强于CIK细胞和LAK细胞(F=6.42～8.26，q=8.02～10.18,P<0.01)，并且杀伤活性随着效靶比的增加而增加。CIK细胞对胶质瘤的杀伤作用强于LAK细胞(q=8.43～9.24,P<0.01)。见表1。CIK细胞对K562细胞的杀伤作用明显强于LAK细胞和负载胶质瘤抗原的DCs激活的CTLs(F=5.36～7.69，q=7.23～9.56,P<0.01)，LAK细胞对K562细胞的杀伤作用强于负载胶质瘤抗原的DCs激活的CTLs(q=8.83～9.15,P<0.01)。见表2。

　　3 讨 论

　　DCs是体内专职抗原提呈细胞，提呈能力是巨噬细胞的10～100倍，是目前发现的唯一能激活未致敏T细胞的抗原递呈细胞(APC)，它能刺激幼稚T细胞增殖，并建立初级免疫反应，控制着体内免疫反应的过程，成为抗肿瘤免疫反应的重要一环[1]。研究显示，T细胞介导的特异性杀伤作用在肿瘤免疫中占主要地位。T细胞活化双信号学说认为[2]：抗原递呈细胞的MHCⅡ类分子抗原肽与T细胞 表1 不同效靶比CTLs、CIK及LAK细胞对神经胶质瘤杀伤作用比较表2 不同效靶比CTLs、CIK及LAK细胞对K562细胞杀伤作用比较表面的TCRCD3复合物结合提供第一信号;APC表面的共刺激分子CD80(B71)、CD86(B72)与T细胞表面的相应受体结合提供第二信号。机体有着强大的免疫监视机制，肿瘤逃避免疫应答的关键在于肿瘤细胞抗原性弱及共刺激信号的缺乏[3]，因此将肿瘤抗原提呈给T细胞是诱导有效抗瘤反应的核心步骤。CIK细胞是MHC非限制性细胞毒细胞[4]，是由外周血单个核细胞诱导而来，诱导时加入的CD3McAb起分裂原刺激作用而使CIK细胞增殖，γIFN先于IL2(24 h)加入培养体系可以提高细胞毒性，在体系中联合应用IL1则可进一步提高细胞毒力，免疫表型测定证实主要是CD3+、CD56+细胞。LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用亦无MHC限制性[5]。

　　本实验证实，负载胶质瘤抗原的DCs激活的CTLs对胶质瘤的杀伤作用明显高于CIK细胞和LAK细胞(P<0.01)，并且杀伤活性随着效靶比的增加而增加，说明DCs已成功摄取胶质瘤细胞抗原并递呈给淋巴细胞激活针对胶质瘤细胞的特异性CTLs,产生了特异性杀伤作用，而CIK和LAK细胞经诱导后虽然杀伤力较前提高，但由于肿瘤细胞的免疫逃逸，不能有效地识别肿瘤细胞，产生MHC非限制性杀伤，因而总的杀伤作用较弱。SCHMIDWOLF等[6]在体外比较了CIK细胞与LAK细胞的细胞毒力，CIK细胞毒力最强的时间为培养的第10～28天，可杀伤2.5～3.5个对数级的肿瘤细胞，而LAK细胞只能杀伤0.5～1.5个对数级的肿瘤细胞，本实验中CIK细胞对胶质瘤和K562细胞的杀伤作用都比LAK细胞强也说明这一点。CIK细胞与LAK细胞对K562细胞的杀伤率高于负载胶质瘤抗原DCs激活的CTLs，表明诱导后CIK细胞和LAK细胞活性增强，由于DCs未负载K562细胞抗原，因此CTLs不能特异性识别K562细胞，非特异性杀伤效率较低。

　　由此可见，从外周血PBMC诱导生成的DCs在体外能有效地递呈胶质瘤细胞的抗原，激活的特异性CTLs能对胶质瘤细胞产生高效而特异的杀伤作用，其杀伤效率明显高于CIK细胞和LAK细胞，为临床应用DCs瘤苗治疗胶质瘤提供依据。

　　目前，树突状细胞在淋巴瘤[7]、黑色素瘤[8]、前列腺癌[9]等肿瘤的Ⅰ、Ⅱ期临床治疗中取得了良好的效果，能明显抑制肿瘤的生长。研究表明，脑组织虽然无完整的淋巴系统，存在血脑脊液屏障但并不是绝对免疫特免区,也存在免疫反应，只不过免疫反应较轻、较慢，因此颅内应用DCs疫苗为治疗脑胶质瘤开辟了一种全新的途径，但树突状细胞疫苗在临床应用时的输入途径、输入时间、输入量等有待于进一步研究。

　　【参考文献】

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　　[3] GABRILOVICH D I, CIEMIK I F, CARBONE D P. Dendritic cells in antitumor immune response.Ⅰ. Defective antigen presentation in tumorbearing host[J]. Cell Immunol, 1996,170:101.

　　[4] SCHMIDWOLF I G H, NEGRIN R S. Phenotypic characterization and identification of effecter cells involved in tumor cell recognition of cytokine induced killer cells[J]. Exp Hematol, 1993, 21: 1673.

　　[5] TAKAHASHI H, NAKADA T, PUSIEUX I. Inhibition of human colon cancer growth by antibodydirected human LAK cells in SCID mice[J]. Science, 1993,259:1460.

　　[6] SCHMIDWOLF I G H, NEGRIN R S, KIEM H, et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokineinduced killer cells with potent antitumor cell activity[J]. J Exp Med, 1991,174:139.

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　　[9] TJOA B A, SIMMONS S J, BOWES V A, et al. Evaluation of Phase Ⅰ/Ⅱ clinical trials in prostate cancer with dendritic cells and PSMA peptides[J]. Prostate， 1998,36(6): 39.