bFGF与EGF诱导BMSCs向神经干细胞分化的观察

　　作者：伦鹏 孟庆海 刘广义 (青岛大学医疗集团，山东 青岛 266003 1 脑科医院神经外科; 2 脑血管病研究所)

　　[摘要] 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)在体外条件下对骨髓基质干细胞(BMSCs)向神经干细胞(NSCs)和神经样细胞分化的诱导作用。方法 采用出生4周左右大鼠的全骨髓细胞进行培养，传至第3代时，分为两组:实验组细胞加入bFGF和EGF，进行诱导分化;对照组不加因子继续培养。在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况，并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗巢蛋白(Nestin)单抗、兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单抗、兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单抗鉴定。结果 实验组诱导7 d后有部分细胞具备神经元样细胞形态，胞体锥形或圆形，有较长单极或多极的突起，均有Nestin、NSE、GFAP阳性细胞表达，且3种细胞数量差别有显著性(t=3.266~6.099,P<0.05)。而对照组细胞仍为典型的成纤维细胞形态，无Nestin、NSE、GFAP阳性细胞。结论 bFGF、EGF可以诱导BMSCs向NSCs分化，并可调控神经元分化，促进神经元细胞成熟。

　　[关键词] 骨髓细胞;干细胞;成纤维细胞生长因子;表皮生长因子;巢蛋白

　　BMSCs DIFFERENTIATION INTO NSCs INDUCED BY bFGF AND EGFLUN PENG， MENG QINGHAI， LIU GUANGYI (Department of Neurosurgery, Brain Hospital of Qingdao University Medical Group, Qingdao 266003, China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo study whether adult bone marrow stromal cells (BMSCs) could be induced to differentiate into neural stem cells (NSCs) and neurons by basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF). Methods Adult marrow stromal cells were cultured from bone marrow of fourweekold Wistar rats. bFGF and EGF were used to induce the thirdgeneration BMSCs, and contrasted with the cells that had not been induced. A phase contrast microscope was used to observe the differentiation of BMSCs, daily. Immunohistochemistry technique was used to identify the differentiated BMSCs with Nestin, neuron specific enolase (NSE) and glial fibrillary acid protein (GFAP). ResultsAfter seven days of culture, some BMSCs appeared typical morphological neuronal traits: the refractile and conelike or spherical cell bodies and long processes, expressed Nestin or NSE or GFAP. The three kinds of cells showed significant difference, but the cells in the control group still had no Nestin or NSE or GFAP expression. ConclusionbFGF and EGF could induce BMSCs to differentiate into NSCs and neurons, and might regulate the differentiation and promote the maturation of neurons.

　　[KEY WORDS]bone marrow cells; stem cells;fibroblast growth factors;epidermal growth factor; nidogen

　　神经系统损伤后的修复是困扰神经科学的一大难题，神经干细胞(NSCs)的发现和移植治疗为解决此难题提供了一条新的途径，并成为近年来的研究热点。然而，传统的胚胎来源和脑来源的NSCs由于取材困难，并受伦理道德的约束，使其应用受到极大的限制。骨髓基质干细胞(BMSCs)具有多分化潜能,可以在体外诱导生成骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞和神经元样细胞[1]。因此，使用来源于骨髓的NSCs治疗神经系统的变性、外伤或遗传性疾病将成为可能。而寻找和探索恰当的细胞因子和培养条件，将BMSCs诱导分化成合适的神经前体细胞，是神经细胞移植的前提条件。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　出生4周左右Wistar大鼠，雌雄不拘，SPF级，体质量150 g，由青岛市实验动物和动物实验中心提供。试剂包括：胎牛血清(GIBCO公司);DMEM/F12培养液(GIBCO公司提供);鼠重组碱性成纤维细胞生长因子(rRbFGF)、鼠重组表皮生长因子(rREGF)(TBD科技公司);兔抗巢蛋白(Nestin)单抗、兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单抗、兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单抗、即用型DAB显色试剂盒、SABC免疫组化染色试剂盒等(武汉博士德生物工程有限公司)。

　　1.2 BMSCs的培养和纯化

　　取Wistar大鼠1只，100 g/L水合氯醛麻醉后，1期伦鹏,孟庆海，刘广义bFGF与EGF诱导BMSCs向神经干细胞分化的观察45体积分数0.75乙醇浸泡3 min，于超净工作台上，严格无菌条件下取大鼠双下肢,剪除软组织，留取股骨和胫骨。将骨骺端剪去，暴露两端骨髓腔，使用5 mL注射器抽取DMEM/F12培养液反复冲洗骨髓腔，冲洗液收集于无菌离心管中，得到细胞悬液1 000 r/min离心3 min。弃去上清液，加入体积分数0.10血清培养液，充分吹打至单细胞悬液，调细胞浓度为4×108/L,接种于培养瓶中。置于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养。48 h后全量换液，去除未贴壁细胞。以后每3~4 d换液一次，待细胞长至80%~90%融合后，用含0.2 g/L EDTA及0.25 g/L胰酶的消化液消化，以细胞密度4×108/L接种传代。

　　1.3 诱导和分化

　　传至第3代时，分为实验组和对照组。实验组加入bFGF、EGF(终质量浓度200 ng/L)培养。对照组不加bFGF、EGF，用原培养液继续培养。每日观察、记录细胞生长情况。

　　1.4 细胞免疫组化染色及观察bFGF、EGF诱导培养后第6天，调细胞浓度为4×108/L，分别将两组细胞接种入24孔培养板，每孔0.5 mL，贴壁24 h后，40 g/L多聚甲醛固定，分别进行Nestin、NSE、GFAP免疫组化鉴定，DAB显色，倒置显微镜下拍照记录，细胞浆呈棕黄色者为阳性细胞。SABC法鉴定细胞成分：一抗分别为Nestin单抗、NSE单抗、GFAP单抗;二抗为羊抗兔或鼠IgG，以确定诱导分化的细胞是否为神经元和胶质细胞。DAB显色法染色，着棕黄色的细胞判定为阳性。阳性对照为星形细胞瘤和神经元肿瘤，阴性对照孔不加一抗。倒置光学显微镜下观察。高倍镜(400倍)下，在每孔的中心和四周随机选择5个视野，进行细胞计数，结果以±s表示，数据间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 BMSCs的形态BMSCs培养24 h后可见细胞贴壁，但混杂有大量红细胞。48 h换液后可除去红细胞，其余贴壁细胞于3~4 d后进入对数增长期，细胞呈集落样生长，形成多个克隆团样结构，10 d左右达到80%~90%融合。倒置显微镜下观察，细胞主要有两种形态：下层为梭形和多角形的成纤维细胞，体积较大，约占90%左右;另有较少的小圆形的多形细胞，折光率较高。

　　2.2 诱导后细胞形态学实验组经bFGF和EGF诱导3 d后，部分细胞呈现神经元样改变，7 d后部分细胞呈现较典型的神经元样改变。细胞体为圆形，内可见明显的细胞核，细胞有细长突起或网状突起。对照组未出现此种细胞。

　　2.3 免疫组化鉴定结果经bFGF、EGF诱导后第7天，实验组出现具有典型神经元形态的Nestin、NSE、GFAP阳性细胞;对照组无Nestin、NSE、GFAP阳性细胞。实验组Nestin、NSE、GFAP阳性细胞占BMSCs总数的比率分别为(33.42±5.38)%、(14.29±4.50)%、(23.20±4.12)%，三者数量差异有显著意义(t=3.266~6.099,P<0.05)。

　　3 讨 论

　　bFGF是一种广谱的神经营养因子，胚胎期脑内的含量很高[2]。EGF在发育脑和成年脑内均有表达，神经元和星形胶质细胞均可表达EGF。有实验证实，bFGF能促进神经元前体细胞的存活或使NSCs向神经元前体细胞分化增殖，从而导致NSCs分化为神经元的比例增多[3]，而EGF则主要刺激胶质前体细胞增殖[4]。但体外实验证实，EGF能促使NSCs存活和增殖，且EGF在NSCs增殖后期发挥作用[5]。bFGF和EGF不只是起到有丝分裂原的作用，也可促进细胞分化并决定细胞分化方向，且这两种生长因子作用的NSCs分化形成的神经元多为氨酪酸能神经元[3]。本实验结果表明，从成年大鼠骨髓中分离得到的BMSCs，可在体外扩增得到大量分化潜能稳定的子代细胞，为下一步BMSCs移植治疗奠定了基础。应用全骨髓贴壁筛选培养法，BMSCs于接种后1 h即开始贴壁，24~48 h完全贴壁，3~4 d后进入对数增长期，14 d左右即长满培养瓶壁。消化传代细胞接种后无增殖潜伏期，可于5 d内再次长满瓶壁。传代后的细胞形态无明显变化且性质稳定。该方法简单高效，易于掌握和推广。bFGF和EGF联合诱导3 d后部分BMSCs可转变为神经元样细胞，出现轴突和树突样结构，且多个神经元间可形成网络连接。诱导7 d后鉴定结果显示,细胞estin表达阳性，说明该细胞有NSCs特性。同时，均有神经元标记物NSE、神经胶质细胞标记物GFAP阳性细胞表 达。但是3种细胞除数量上有明显差别外，形态上并无显著区别，提示部分细胞可能同时表达两种蛋白，尚处于神经元或神经胶质细胞的前体阶段。说明该细胞可继续诱导分化为更成熟的神经细胞。而对照组无阳性细胞出现。本实验证实，两种细胞因子协同诱导BMSCs，主要获得表达Nestin的NSCs，并可以使NSCs继续成熟分化并出现表达NSE的神经元细胞，表达GFAP的神经胶质细胞。应用本实验方法，短时间内可以获得较多的NSCs和神经元样细胞，多次传代后细胞形态和性质稳定，为今后开展NSCs移植研究，体外扩增足量来源广泛、向神经元方向分化的NSCs奠定了实验基础。目前，在体内或体外拟诱导NSCs特异地分化为特定表型的神经元尚有一定困难，随着对细胞因子在NSCs增殖分化过程中作用的进一步研究和与基因调控手段的结合，有望能精确地控制NSCs向功能神经细胞分化的比例，对NSCs移植治疗中枢神经系统疾病有重大意义。

　　[参考文献]

　　[1]BRAZELTON T R , ROSSI F M, KESHET G I, et al. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice.[J]. Science, 2000,290(5497):17751779.

　　[2]FUSE K, TINNER B, ZOLI M, et al. Computerassisted mapping of basic fibroblast growth factor immunoreactive nerve cell population in the rat brain[J]. J Chem Neuroanat, 1996,11(1):1335.

　　[3]UCHIDA, BUCK D W, HE D, et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci, 2000, 97(26):1472014725.

　　[4]WHITTEMORE S R, MORASSUTTI D J, WALTERS W M, et al. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations[J]. Exp Cell Res, 1999, 252(1):7595.

　　[5]CICCOLINI F. Identification of two distinct types of multipotent neural precursors that appear sequentially during CNS development [J]. Mol Cell Neurosci, 2001, 17(5): 895907.