Letin、PTTG、Ki 67的表达与垂体腺瘤侵袭性的研究

 作者：李军,牛朝诗,丁敏

【摘要】  目的 探讨Letin、PTTG、Ki 67的表达与垂体腺瘤侵袭性的关系及临床意义。 方法 采用免疫组织化学染色方法检测51 例垂体腺瘤 （侵袭性垂体腺瘤 34 例，其中功能性腺瘤27例，无功能腺瘤7例；非侵袭性垂体腺瘤 17 例，其中功能性腺瘤15例，无功能腺瘤2例） 组织中Letin、PTTG、Ki 67的表达水平，并进行相关性分析。 结果 在全部侵袭性垂体腺瘤、功能腺瘤组和无功能腺瘤组中，Letin呈低水平表达，分别为24% （P ＜0.01），22% （P ＜0.01），29% （P ＞0.05)；PTTG呈高水平表达，分别为94% （P ＜0.01），96% （P ＜0.01），86% （P ＞0.05）；Ki 67呈高水平表达，分别为85% （P ＜0.01），85% （P ＜0.01），86% （P ＞0.05）。相关分析显示，在侵袭性垂体腺瘤中Leptin的表达与PTTG的表达呈负相关 （r = －0.45，P ＜0.01）。 结论 Leptin、PTTG和Ki 67的表达与垂体腺瘤的侵袭性有关， Leptin与PTTG的表达存在负相关，尤其是在功能性腺瘤的侵袭性中扮演重要角色，可用作垂体腺瘤侵袭性的评估指标，联合检测有助于判断垂体腺瘤的侵袭性。

【关键词】  垂体肿瘤； 瘦素； 癌基因； 增殖细胞核抗原

    Expressions and significance of Letin, PTTG and Ki 67 in invasive pituitary adenomas

    LI Jun1, 2, NIU Chaoshi1, DIN Min3

    1. Department of Neurosurgery;  3. Department of Pathology, Anhui Province Hospital, Anhui Medical University, Hefei 230001, China;

    2. Department of Neurosurgery, the First Hospital of Hefei, Hefei 230061, China

    Abstract：  Objective  To study the protein expression of Leptin, PTTG and Ki 67 in invasive pituitary adenomas and the relationship between them.  Methods  The protein expressions of Leptin, PTTG and Ki 67 in 51 patients with pituitary adenomas (34 cases in invasive group, including 27 functional and 7 non-functional, 17 cases in non-invasive group) were assayed by immunohistochemical staining technique, with a correlation analysis.  Results  In all invasive pituitary adenomas, including functioning pituitary adenomas and non-functioning pituitary adenomas, the protein expression of Leptin was lower: 24% (P ＜0.01), 22% (P ＜0.01) and 29% (P ＞0.05) respectively, the protein expression of PTTG was higher: 94% (P ＜0.01), 96% (P ＜0.01) and 86% (P ＞0.05) respectively, and the protein expression of Ki 67 was also higher: 85% (P ＜0.01), 85% (P ＜0.01) and 86% (P ＞0.05) respectively. A correlation analysis revealed that there was a negative correlation between Leptin and PTTG in invasive pituitary adenomas (r = －0.45, P ＜0.01).  Conclusion  Leptin, PTTG and Ki 67 may be correlated with the invasiveness of pituitary adenoma, especially in the invasive potential of function adenomas, and a valuable biological predicting marker.

    Key words：  pituitary neoplasms;  leptin;  oncogenes;  proliferating cell nuclear agtigen

    侵袭性垂体腺瘤是指肿瘤突破垂体包膜，向周围组织结构浸润生长，影响病人的手术疗效及预后。本研究应用免疫组织化学染色方法检测瘦素基因蛋白 （leptin）、垂体瘤转化基因 （pituitary tumor transforming gene，PTTG） 蛋白、增殖细胞核抗原Ki 67的表达情况，探讨三者与垂体肿瘤侵袭性和增殖能力的关系。

 1    材料与方法

    1.1    标本来源    均为安徽医科大学附属省立医院经手术和病理证实的垂体腺瘤，其中男28例，女 23例；年龄17～68岁，平均39岁。根据术前内分泌检查和病理激素免疫标记结果，分为功能性腺瘤42例，非功能性腺瘤9例。根据术前MRI检查结果，按肿瘤直径分为巨大垂体腺瘤 （最大径＞3 cm） 26例，大腺瘤 （最大径1~3 cm） 21例，微腺瘤 （最大径≤1 cm） 4例。

    1.2    垂体腺瘤侵袭性的判断    判断标准[1]：①海绵窦内颈内动脉 （ICA） 被肿瘤包裹部分＞30%为早期侵袭的判断标准，Knosp分级Ⅲ级以上或改良的Hardy分级Ⅲ级及以上；②术中镜下观察周围硬膜、骨质、海绵窦等是否受肿瘤侵犯；③ 取检物经病理证实。本组根据术前影像学 （垂体冠状CT、MRI检查结果），部分结合术中所见及术后病理结果对肿瘤有无浸润周围组织结构进行判断，分为侵袭组34例，非侵袭组17例。

    1.3    试剂与实验方法    本实验采用链霉素抗生物蛋白过氧化酶免疫组织化学染色法 （S-P法），所有试剂包括一抗和二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Leptin一抗和PTTG一抗为兔抗人多克隆抗体，Ki 67一抗为鼠抗人单克隆抗体；Leptin一抗稀释浓度为1∶100，PTTG一抗和Ki 67一抗为即用型。标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，3 μm层厚连续切片，Leptin、PTTG采用微波法抗原热修复，Ki 67采用煮沸法抗原修复，常规S-P免疫组织化学染色。以PBS代替一抗作阴性对照，已知苏木精-伊红染色作组织学参照。

    1.4    结果判定    Leptin和PTTG以细胞质出现黄色或棕黄色染色颗粒者为阳性细胞 （图1，2），连续观察5个高倍视野，根据阳性细胞占所有肿瘤细胞的比例和强度记录半定量结果：阴性 （－）：无阳性细胞或阳性细胞＜10%，记录为0级；（+）：阳性细胞10%～20%，记录为1级；（++）：阳性细胞20%～50%，记录为2级；（+++）：阳性细胞＞50%，记录为3级。Ki 67以细胞核被染成棕黄色或棕褐色为阳性细胞 （图3），连续观察5个高倍视野，取阳性细胞数均值并计算增殖细胞标记指数LI = （阳性细胞数/所计细胞总数） × 100%，LI ＜3%为 （－），记录为0级；LI 3%～5%为 （+），记录为1级；LI ＞5%～10%为 （++），记录为2级；LI ＞10%为 （+++），记录为3级。

    1.5    统计学分析    数据采用SPSS 12.0软件包。计数资料的组间比较、相关分析采用卡方检验、Fisher精确概率法及Spearman等级相关分析法；Logistic回归方程进行多因素分析。显著性检验标准为α = 0.05。

    2    结    果

    2.1    Leptin、PTTG、Ki 67在垂体腺瘤中的表达 （表1）    在34例侵袭性垂体腺瘤中，8例表达Leptin，阳性率为24%；17例非侵袭性垂体腺瘤中16例表达Leptin，阳性率为94%；侵袭性垂体腺瘤Leptin表达显著低于非侵袭性垂体腺瘤 （χ2 = 22.67，P ＜0.01） （图1）。PTTG、Ki 67在34例侵袭性垂体瘤中的表达阳性率分别为94%、85%，显著高于非侵袭性垂体瘤的41%、24% （χ2 = 14.83，18.93，P ＜0.01） （图2、3）。在42例功能性垂体腺瘤中，侵袭性组的Leptin阳性率为22%，而非侵袭性组均有表达 （χ2 = 23.33，P ＜0.01)；PTTG、Ki 67在侵袭性组的阳性率分别为96%、85%，显著高于非侵袭性组的40%、20% （χ2 = 13.89、17.37，P ＜0.01）。在9例无功能性垂体腺瘤中，Leptin在侵袭组的阳性率为29%，低于非侵袭组的50%，但P ＞0.05；PTTG和Ki 67总阳性率均为86%，与非侵袭组比较均无统计学差异。

2.2    Leptin、PTTG、Ki 67在侵袭性垂体腺瘤的相关性及影响因素 （表2）    在侵袭性垂体腺瘤中Letin的表达与PTTG表达呈负相关 （r =－0.45，P ＜0.01），而PTTG和Ki 67、Leptin和Ki 67之间存在一定的正趋势，但无统计学意义 （P ＞0.05）。多因素Logistic分析 （Forward：conditional法，变量进入方程的标准α = 0.05，变量剔除出方程的标准β = 0.1） 表明Leptin、PTTG、Ki 67在侵袭性垂体瘤中的表达与年龄、性别、肿瘤大小和病理类型无关。

    3    讨    论

    瘦素 （leptin） 是由第7号染色体的q31.3上的瘦素 （obese，OB） 基因编码的表达产物，主要由脂肪组织分泌，调节人体能量平衡、生长发育、脂肪代谢。研究显示：正常下丘脑、垂体细胞也能合成和分泌瘦素蛋白，参与下丘脑-垂体神经内分泌调节[2]。瘦素是以分泌颗粒的形式存在于细胞质中，在大多数正常垂体前叶细胞中均能检测到， Korbonits等[3]在近50%的垂体腺瘤中检测到瘦素表达，染色强度较正常垂体细胞弱。本研究发现，瘦素在垂体腺瘤总的表达阳性率为47%，在侵袭性垂体腺瘤中阳性率为24%，而在非侵袭性腺瘤阳性率为94%，差异性具有统计学的意义 （P ＜0.01）；瘦素在功能性垂体腺瘤中的侵袭性组和非侵袭性组间的表达差异也具有统计学意义，但在无功能性垂体腺瘤中无类似结果。Isono等[4]统计分析了35例功能性垂体腺瘤，其中9例侵袭性垂体腺瘤中只有1例瘦素表达阳性，且与肿瘤的大小无关。文献报道在生长激素 （GH） 腺瘤中，瘦素对生长激素的释放有轻度抑制性[5]。Jin等[6]在体外实验中发现瘦素能够抑制人垂体腺瘤HP75细胞株和鼠GH3细胞株的繁殖和分化，且瘦素缺限鼠的垂体非常肥大，我们的研究结果也认为：瘦素高表达的垂体腺瘤有较低的侵袭性和增殖性，但具体机制不明。Jin等[6]提出可能是IL-1、IL-2 、IL-6对垂体肿瘤细胞增殖具有抑制作用，而瘦素与IL-1、IL-2、 IL-6在垂体腺泡细胞中呈现共区域化的特点，猜测它们同属一类细胞调节因子超家族，参与抑制垂体肿瘤细胞增殖和分化，肿瘤侵袭性的发生就是肿瘤细胞逃脱了瘦素和其他抑制因子的监控。

    PTTG是原癌基因之一，与垂体腺瘤侵袭性关系密切[7]。PTTG过度表达引起了遗传的不稳定性和染色质的重组、高尔基体的活动增加及分泌囊泡的增多，诱导肿瘤血管生成因子 （如 FGF-2 、VEGF） 的分泌，促进肿瘤增殖和侵袭性的发生。一般认为，增殖活性高的肿瘤具有更强的侵袭性，而Ki 67是细胞周期特异性抗原，在G1中期开始出现，在M期达到高峰，在有丝分裂后迅速降解并失去抗原决定簇，能客观反映增殖的潜力。Filippella等[8]认为Ki 67是预测肿瘤侵袭、复发的最好指标，比PTTG更有价值，并将Ki 67 LI＞2.9%作为阳性和阴性的阈值 （CUT-OFF），与WHO 的Ki 67 LI = 3%相近似，但垂体腺瘤属偏良性肿瘤，Ki 67的表达强度不会太高，也有研究将Ki 67 LI ＞1.5%作为阈值 （CUT-OFF），甚至有研究认为Ki 67与侵袭性无关[4，9]。我们发现在侵袭性垂体腺瘤中，尤其是功能性垂体腺瘤的侵袭组中，PTTG和Ki 67的阳性表达率高，并且是有意义的，而在无功能性腺瘤的侵袭组虽然表达率也高，但无统计意义，与瘦素的分析类似。Leptin、PTTG、Ki 67的表达在功能性垂体腺瘤侵袭组和无功能性垂体腺瘤侵袭组中的意义虽然不同，而我们对侵袭性垂体腺瘤采用多因素回归分析的结果为3个指标均不受年龄、性别、肿瘤大小和病理类型的影响，这可能与本组总病例数，尤其是无功能腺瘤的病例数较少有关，但这种区分研究报道少，结论也有差异[10]，值得今后进一步研究。

    目前判断垂体腺瘤侵袭性的生物学指标虽然不少，但无金标准，而且方法、判断标准等不同，有时结论可能相反。我们通过研究认为：Leptin、PTTG和Ki 67的表达与垂体腺瘤的侵袭性有关，尤其是在功能性腺瘤的侵袭性中扮演重要角色，但在无功能腺瘤的侵袭性方面作用不清楚；在侵袭性垂体腺瘤中Leptin呈低水平表达，PTTG、Ki 67呈高水平表达，且Leptin与PTTG的表达存在明显的负相关，提示侵袭性垂体腺瘤常伴有基因调控水平的障碍，抑瘤因素的减弱和癌基因活跃是侵袭性发生的主要始动因素，导致肿瘤细胞增殖活性提高，侵袭性增加。联合检测Leptin、PTTG和Ki 67有助于判断垂体腺瘤的侵袭性，对预测预后、复发均能提供帮助。

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