电针体穴治疗对大脑中动脉梗死模型大鼠胆碱乙酰转移酶表达的影响

　　作者：田明秀 陈加俊　怀淑君 杨秀峰 作者单位：(吉林大学第一临床医院神经内科，吉林 长春 130021)

　　【摘要】 目的 观察电针体穴治疗后大脑中动脉梗死模型(MCAO)大鼠胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达变化,为探讨针刺改善学习记忆能力提供理论依据。方法 将大鼠随机分为对照组(正常大鼠)、实验组(局灶性脑缺血的大鼠)、治疗组(局灶性脑缺血的大鼠+针刺)，采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术观察各组大鼠ChAT的动态变化。结果 治疗组大鼠ChAT活性比实验组有显著提高( P<0.01 ) ，并已接近对照组的正常大鼠。结论 MCAO大鼠经针刺治疗后ChAT的阳性表达可能是学习记忆障碍的神经生物学基础之一。

　　【关键词】 针刺;大脑中动脉;梗死;胆碱乙酰转移酶;RTPCR

　　中枢胆碱能系统在学习记忆行为中有重要的调节作用。有报道〔1〕学习记忆障碍动物脑中与学习记忆过程相关的神经递质〔如乙酰胆碱(Ach)〕及其酶的含量与代谢存在变化。而胆碱能神经功能紊乱被认为是学习记忆障碍的主要原因，胆碱乙酰转移酶(ChAT)是与学习记忆最相关的神经递质Ach的代谢合成酶，ChAT在记忆相关脑区的含量高低与学习记忆能力成正相关。本实验通过系统观察电针治疗前后大脑中动脉梗死(MCAO)模型大鼠的ChAT表达的改变,探讨学习记忆障碍的神经生物学基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 模型制备与分组 实验用纯系Wistar大鼠，雌雄不分，体重200～300 g，全部实验用大鼠均由长春市高新技术开发区动物繁殖中心提供。实验动物以10%的水合氯醛(0.32 ml/100 g)腹腔麻醉后，仰卧固定于手术台上。颈部正中切开皮肤及浅筋膜，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，暴露颈总动脉(CCA)与迷走神经，在颈总动脉近心端结扎，结扎颈外动脉(ECA)主干，用双极电凝器电凝联系ECA与颈内动脉之间的动脉分支，在颈内动脉穿线备用，在CCA结扎的上端距离CCA分叉处剪一小口，用制备好的鱼线沿CCA插入颈内动脉，当到达指定长度〔(18.50±0.50)mm〕时结扎颈内动脉。线栓尾端留0.20 mm于ECA切口处，最后消毒、缝合皮肤。此法〔7〕造成左侧大脑中动脉供血区永久性局灶性缺血。术后随机分组，每24只为一组，分为实验组(局灶性脑缺血的大鼠)、治疗组(局灶性脑缺血的大鼠+针刺)。以上两组与对照组(正常大鼠)各分成四个时间点，分别为6 h、24 h、3 d、7 d。提取各组各时间段的大鼠脑组织。

　　1.2 电针方法 治疗组动物清醒后立即给予针刺，其中双侧内关穴及双侧足三里穴加电针，强度以大鼠肢体颤动为度，百会穴施以平补平泻法，以医生手下感到沉紧为度。

　　1.3 仪器及试剂 主要实验仪器:超速低温离心机，Germany Heraeus;紫外分光光度仪，上海第三分析仪器厂，PCR仪：America BIORAD company;水平电泳仪，北京六一仪器厂;紫外透射反射检测分析仪，上海复生生物工程研究所;数码照相机，SEAGULL DF2。主要实验试剂 ：RNA提取试剂盒(Promega产品);逆转录试剂盒(MBI产品);Tag pluIDNA聚合酶(Sangon产品);DNAMarker、琼脂糖、DEPC、饱和酚等试剂均购自宝生物工程有限公司。ChAT、βactin引物序列。ChAT正义链5′GTCTTGGATGTTGTCATTAATTTC3′;反义链5′TCTCTGGTAAAGCCTGTAGTAAGC3′;扩增片段长度708 bp;内参照βactin;正义链5′CTTCTACAATGAGCTGCGTG3′;反义链5′TCATGAGGTAGTCAGTCAGG3′;扩增片段长度 305 bp;以上引物由大连宝生物工程有限公司合成。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 提取总RNA 采用异硫氰酸胍法提取总RNA。取冰冻组织(0.1～0.2 g)剪碎后加入异硫氰酸胍变性液2 ml(100 mg/ml)，冰上匀浆后，分装，每管各500 μl。每管依次加入50 μl 2 mmol/L的乙酸钠;500 μl水饱和酚;氯仿/异戊醇(24∶1)100 μl，冰浴操作，充分混匀，4℃孵育15 min。12 000 r/min， 4℃离心20 min，小心移上层水相至另一新的EP管中;加等量的异丙醇，-20℃沉淀1 h;4℃，10 000 r/min离心10 min。弃上清，悬RNA于75%乙醇150 μl中，振荡，室温孵育10 min;4℃，10 000 r/min离心5 min;弃上清，总 RNA干燥至透明前。依据总RNA量多少加20～40 μl不等的0.1%焦碳酸二已酯(DEPC)溶解RNA。用紫外分光光度仪测总RNA的产量，纯度及浓度(波长260 nm/280 nm)。

　　1.4.2 cDNA的合成 据总RNA的浓度取适量的总RNA，使逆转录的总RNA量为8 μg，先65℃水浴10 min，RT 反应液中依次加入5×Reaction buffer 4 μl;20 U/μl Ribonuclease inhibitor 1 μl;2.5 mmol/L dNTPs 2 μl;100 μg/ml Oli(dT)18 1 μl;100 U/μl AMV 2 μl;总RNA 2～4 μl;加0.1%DEPC水至总体积20 μl。将上述混合液加入薄壁离心管中，置入PCR仪，反应条件为42℃，60 min，后95℃，10 min，得到cDNA。

　　1.4.3 PCR反应 PCR反应体系为：D.W26 μl;10×PCR buffer 5 μl;25 mmol/L MgCl 3 μl;2.5 mmol/L dNTPs 4 μl;引物正义链1 μl;引物反义链1 μl;cDNA 10 μl;引物浓度为30 pmol/μl。①目的基因的扩增：上述反应液先94℃，5 min，之后加入Taq plusDNA聚合酶0.5 μl/每管，用ChAT 的引物进行PCR，循环30个周期。②内标准β肌动蛋白(βactin)的扩增：上述反应液先94℃，5 min，之后加入Taq plusDNA聚合酶0.5 μl/每管，用βactin的引物进行PCR，循环30个周期。ChAT的PCR反应条件为94℃，30 s;60℃，30 s;72℃，1 min。

　　1.4.4 PCR产物定量 10 μl PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察结果，拍照。通过图像分析将ChAT与βactin灰度比值进行相对定量。

　　1.5 统计学处理 方差齐性检验，两均数比较采用t检验。

　　2 结 果

　　造模后大鼠ChAT因缺血荧光定量明显缺失，与正常对照组相比差异有显著性(P<0.01 )。治疗组经电针治疗后7 d ChAT荧光定量接近正常，与实验组相比差异有显著性(P<0.01 )。见图1。

　　图1 组间比较ChAT含量

　　3 讨 论

　　3.1 学习记忆相关的系统和神经生物学物质 中枢胆碱能系统与学习记忆密切的关系〔2〕。中枢胆碱能系统的核团主要集中基底前脑，统称为基底大细胞核群，其核团中的隔内侧核和斜角带垂直部其胆碱能纤维经过穹窿主要投射到海马结构。无名质及白球腹侧部(大细胞基底核)的胆碱能纤维广泛投射到大脑新皮层〔3〕。实验证明隔核海马的传导通路与空间识别、工作记忆有关，大细胞基底核大脑物质的传导通路与学习过程的调制、参照记忆有关〔4〕。它们的损伤可导致皮质、海马以及大细胞基底核细胞萎缩及ChAT 和乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AchE)活性明显降低和学习、记忆功能的损害〔5〕。胆碱能功能体系包括Ach、ChAT和AchE。生物学测定发现，脑内大部分区域这三者间有着较好的一致性〔6〕。但AchE在中枢神经系统的分布比较广泛，不仅存在于胆碱能细胞，也存在于非胆碱能细胞中，而ChAT是Ach的合成酶，它与Ach的分布几乎平行，故常作为研究胆碱能神经的标记酶或估计Ach含量的间接指标。ChAT是Ach的生物合成酶，是胆碱能系统活性的特异性标志。

　　3.2 ChATAch Ach存于胆碱纤维末梢的突触小泡内。Ach的合成、转运、释放和灭活过程。有胆碱转运系统、ChAT，胆碱受体和AchE 4类高度特异性蛋白参与。Ach很大程度上有赖于突触小泡功能正常和ChAT的促进合成〔8〕，换句话说，突触小泡膜蛋白和ChAT的生物活性和含量对Ach促进学习记忆的生物学功能的正常发挥可能起关键性的作用。ChAT主要存在胆碱纤维能纤维的胞浆内，与乙酰辅酶A和胆碱结合，将乙酰辅酶乙酰基转移到胆碱上，合成的Ach主要储存于突触小泡内。由于ChAT可合成Ach，而Ach具有促进学习记忆的生物功能，因此认为ChAT在脑内的含量高低与动物学习记忆能力强弱成正相关。其证据来源于对阿尔茨海默病和轻度认知障碍病理发生过程中的研究〔1，8〕。这些研究证明ChAT与认知功能存在直接因果关系。

　　3.3 针刺对中枢胆碱能系统的影响 近年的针刺研究中发现，针刺对大脑神经递质的释放和传递有着广泛的影响，特别是对中枢胆碱能系统作用的影响不仅仅局限于针刺镇痛方面，通过对AchE和Ach活性和含量的影响，发挥着对中枢神经系统功能方面的调节作用〔9〕。RTPCR是分子生物技术实验室中的首选方法之一，具有简便、安全、快速、灵敏、特异性强等特点，近年来广泛应用于动物的微生物检测〔10〕。我们应用荧光定量 RT PCR技术，通过对大鼠脑梗死后ChAT的动态变化及针刺后的影响的研究，来探讨学习记忆障碍的神经生物学基础可能机制及针刺的影响，以便进一步研究脑功能及临床应用。本实验证实造模后大鼠ChAT因缺血荧光定量明显缺失，与正常对照组相比差异有显著。治疗组经电针治疗后7 d ChAT荧光定量接近正常，与实验组相比差异有显著性。说明电针治疗可促进ChAT的表达，对大鼠的学习记忆障碍有改善作用，可能与针刺效应改变了大脑AchE、ChAT活性及Ach含量，进而增强了中枢胆碱能系统的功能活动有关，但学习记忆障碍还有其他因素的参与，有待于更深入的研究。

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