6羟基多巴胺诱导SHSY5Y细胞帕金森病模型中1433蛋白表达的研究

　　作者：王丹萍 常 明 解洪荣 田明秀 胡林森 作者单位：(吉林大学第一医院神经内科蛋白质组学实验室，吉林 长春 130021)

　　【摘要】 目的 应用蛋白质组学技术研究6羟基多巴胺(6OHDA)诱导SHSY5Y细胞帕金森病(PD)模型中1433蛋白的表达变化。方法 在建立6OHDA诱导SHSY5Y细胞PD模型的基础上，分别提取6OHDA实验组和对照组孵育24 h的细胞总蛋白，应用荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息，运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDITOF MS)鉴定出差异蛋白质。结果 DIGE分析发现实验组有一个表达明显上调的差异蛋白质点(P<0.05)，经质谱分析鉴定确认为1433蛋白。结论 6OHDA诱导SHSY5Y细胞的PD模型中1433蛋白表达上调，提示1433蛋白上调可能与PD的发病机制有关。

　　【关键词】 6羟基多巴胺;SHSY5Y;帕金森病;1433蛋白;IDGE

　　帕金森病(PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病，其病理特征是中脑黑质致密部多巴胺(DA)能神经元进行性变性、坏死，但PD的发病机制现仍不完全清楚。神经毒素6羟基多巴胺(6OHDA)是DA神经递质的羟基化类似物和选择性DA神经元化学损毁剂，它选择性地作用于DA神经元，适用于研究DA能神经变性的详细机制及筛选新的治疗药物。SHSY5Y细胞系来源于人神经母细胞瘤株，其分化程度低、繁殖快，细胞形态、生理及生化功能与人正常神经细胞相似〔1〕。迄今为止尚无应用蛋白质组学技术对该模型进行系统研究的报告。本实验在建立6OHDA诱导SHSY5Y细胞PD模型的基础上应用荧光差异凝胶电泳(Differential Gel Electrophoresis，DIGE)技术研究6OHDA对SHSY5Y细胞毒性作用机制中的相关蛋白，为PD的发病机制及临床治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞、试剂及仪器 SHSY5Y细胞来自American Type Culture Collection(ATCC)。6OHDA、DMSO、胰蛋白酶购自Sigma公司。高糖DMEM培养基购自Gibco公司;新生胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;Cleanup试剂盒、2D Quant试剂盒、固相24 cm IPG胶条(pH4～7)、CyDye荧光染料(Cy2，Cy3，Cy5)以及其他双向电泳和质谱分析试剂，Ettan IPGphor Ⅱ等电聚焦仪、DALT Six垂直电泳系统、切胶仪、酶切仪、点靶仪和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDITOF MS)均购自Amersham BiosciencesGE Healthcare公司。荧光倒置显微镜为Olympus公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 用含5%的新生胎牛血清、100 μg/ml青霉素/链霉素的高糖DMEM培养基培养细胞，置于37℃、5% CO2培养箱中，隔天换液。待细胞进入对数生长期后，用0.25%的胰蛋白酶消化后，以2×105/ml密度接种于底面积25 cm2的培养瓶(15 ml/瓶)。孵育24 h后，实验组和对照组分别加入6OHDA(终浓度为6OHDA 100 μmol/L，VitC 0.002%)和0.2% VitC溶液(终浓度为0.002%)，继续孵育24 h。取4批不同代数的细胞进行培养。

　　1.2.2 蛋白提取 收取细胞，加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，30 mmol/L Tris)，经室温作用1 h后离心取上清。蛋白样品经cleanup试剂盒去除杂质后，再用2D Quant试剂盒测定浓度。

　　1.2.3 DIGE 将各样品pH值调至8.5，进行分组并制备内标，再以400 pmol CyDye：50 μg蛋白的比例标记各样品及内标，避光冰浴30 min后，用1 μl 10 mmol/L赖氨酸终止反应。分析胶：内标蛋白、对照组及实验组蛋白分别进行荧光(Cy2、Cy3、Cy5)标记。按标准实验规程进行水化及聚焦电泳：采用线性IPG胶条(pH4～7)，定量蛋白上样，水化和电泳，并灌制24 cm×20 cm PAGE胶，进行IPG胶条平衡及转移，24 cm电泳仪垂直电泳。制备胶：取对照组及实验组蛋白样品各800 μg，酸性端放置蛋白分子量标志，按分析胶方法进行双向电泳。考马斯亮蓝染色。

　　1.2.4 图像分析及统计学处理 使用Typhoon 9400扫描仪对分析胶进行图像扫描，并且以De CyderTM分析软件进行蛋白变化比对，其中AV比值>1.5，配对t检验P<0.05为有显著差异的蛋白点。切取与差异蛋白相匹配的制备胶蛋白点，经酶切(20 μg/L胰酶，37℃，2 h)、点靶后，应用MALDITOF MS分析蛋白质肽质量指纹谱，并将结果输入NCBI蛋白质数据库进行检索和鉴定。

　　2 结 果

　　应用DeCyder软件分析6OHDA实验组与对照组蛋白质表达量差异。其中编号为1 584的蛋白点，出现率100%，实验组较对照组升高1.67倍，差异有显著性(P<0.05)，见图1。经MALDITOF质谱分析，该蛋白为1433蛋白(期望值：O.009;序列覆盖率：30.2%;NCBI数据库编号：gil3928824)，肽质量指纹谱见图2。

　　3 讨 论

　　1433蛋白是1433酸性蛋白家族成员，广泛分布于从植物到哺乳动物等所有真核生物中，哺乳动物有7种异构体，主要以同源或异源二聚体形式存在于细胞质中〔2〕，通过磷酸化丝/苏氨酸作用与靶蛋白或靶蛋白的两个结构域结合。1433蛋白参与细胞的多种生理过程并在其中发挥重要作用，例如调节细胞凋亡、促细胞分裂信号传导，以及对细胞生长、分化、黏附、增殖和离子通道的调节〔3，4〕。

　　Rafl是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞的生长、分化和肿瘤基因的转化中发挥重要的作用。研究已经证实1433蛋白通过对Raf 1途径的调节在中枢神经系统的神经元分化和功能上发挥重要作用，它能够刺激有活性和无活性的Rafl的迅速转换，介导Rafl与其他蛋白之间的相互联系并且激活Rafl，使MAP激酶磷酸化，刺激MAPK从而使基因转录导致细胞分裂〔5〕。1433蛋白能与Rafl、PKC、Cdc25C、KSR、Bcr、Ca2+/CaM激酶、Bad和跨膜蛋白受体等多种信号蛋白结合，这说明1433蛋白在信号转导过程中发挥着重要作用〔6〕。已有实验表明1433蛋白过表达通过上调Bcl2蛋白表达并下调Bad蛋白表达，减少了MPP+诱导的PC12细胞的凋亡〔7〕。1433配体Bad(与Bcl2相关的死亡蛋白)是连接胞内存活/凋亡信号与线粒体凋亡机制的重要环节。在正常细胞，Bad分布在胞质;当有凋亡信号时，Bad进入线粒体与BclxL或Bcl2结合促进细胞凋亡。通过与Bad的结合，1433蛋白由于将Bad隔离于胞液而防止了细胞凋亡〔8〕。

　　PD的一个主要特征是黑质多巴胺能神经元坏死，伴有纹状体内多巴胺含量减少。酪氨酸羟化酶是多巴胺合成的限速酶，1433蛋白与酪氨酸羟化酶的结合是酪氨酸羟化酶最佳的磷酸化活化方式〔9〕。1433蛋白能够抑制酪氨酸羟化酶去磷酸化，延长并提高酪氨酸羟化酶的活性，增加多巴胺的产生〔10〕。研究证实抑制1433表达对细胞是有害的，1433等亚型及其特殊功能可以作为选择性的药物治疗靶点〔11〕。

　　DIGE系统在双向电泳技术的基础上，结合多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，是目前定量蛋白质组学研究中可信度和准确性最高的技术之一〔12〕。本研究应用DIGE技术对6OHDA诱导SHSY5Y细胞的PD模型进行研究，证实1433蛋白表达显著增高。认为1433蛋白表达增高是细胞对6OHDA神经毒素的一种防御性保护反应，可提高酪氨酸羟化酶的活性，增加DA的产生;可通过与Bad的结合防止细胞凋亡;从而发挥对SHSY5Y细胞的保护作用。这些结果可能为PD的治疗提供新的药物靶点。同时本研究中1433蛋白表达增高进一步证明了1433蛋白确实参与PD的病理生理过程，可能与PD的发病机制有关。

　　【参考文献】

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　　7 Chen XW,Sun SO,Cheng DB，et al.Overexpression of 1433 protein protects pheochromocytoma cells against 1methyl4phenylpyridinium toxicity〔J〕.Neurosci Bull，2006;22(5)：2817.

　　8 Masters SC，Yang HZ，Datta SR，et al.1433 inhibitors Badinduced cell death through interaction with Serine136〔J〕.Mol Pharmacol，2001;60(6)：132531.

　　9 Kleppe R,Toska K,Haavik J.Interaction of phosphorylated tyrosine hydroxylase with 1433 proteins:evidence for a phosphoserine 40dependent association〔J〕.J Neurochem,2002;22(8):30909.

　　10 Toska K,Kleppe R,Armstrong GG,et al.Regulation of tyrosine hydroxylase by stressactivated protein kinases〔J〕.J Neurochem,2002;83(4):77583.

　　11 Kawabe T.G2 checkpoint abrogators as anticancer drugs〔J〕.Mol Cancer Ther,2004;3(4):5139.

　　12 侯 澍，胡林森，常 明，等.NGF诱导PC12细胞早期分化的DIGE分析〔J〕.脑卒中与神经疾病杂志，2006;23(1)：524.