神经干细胞脑室内移植治疗大鼠脑缺血的实验研究

　　作者：杨东波 李永利 杨立庄 蒋传路 叶 伟 作者单位：哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科， 黑龙江 哈尔滨 150086

　　【摘要】 目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞移植治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的可行性。 方法 取胎龄8～10 d大鼠神经干细胞体外扩增，采用免疫组织化学方法检测神经干细胞及其分化后代的特异性标志巢蛋白 (nestin)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 和神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 的表达。以Brdu表记神经干细胞，分别于缺血后24 h和4周移植至局灶性脑缺血大鼠模型的脑室内和梗死中心，比较不同移植部位和不同移植时间神经干细胞的存活、增殖和迁移情况。 结果 移植后可见移植细胞存活至少8周以上，移植部位不同不影响细胞存活。脑室内移植细胞向脑缺血区域迁移，且以缺血后24 h移植组较缺血后4周移植组迁移趋向性更强。 结论 大鼠胚胎神经干细胞移植至局灶性脑缺血大鼠脑室内和梗死中心均可长期存活并广泛迁移，其迁移趋化能力与缺血后移植时间有关。

　　【关键词】 干细胞移植 再灌注损伤 脑缺血 大鼠 Wistar

　　YANG Dongbo, LI Yongli, YANG Lizhuang, et al

　　Department of Neurosurgery, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, China

　　Abstract: Objective To explore the feasibility of neural stem cells (NSCs) transplantation for focal brain ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Rat NSCs of 8 to 10 day gestational age were adopted for amplification in vitro, and detected by immunohistochemistry for the expression of nestin as a specific mark of NSCs, glial fibrillary acidic protein and neuron-specific enolase, and then implanted into the ventricle or central site in the infarcted area of the rat models 24 hours and 4 weeks after the ischemia respectively. Brdu labeling method was used to mark the transplanted NSCs and their offsprings. The differences in survival, proliferation, and migration were compared between the NSCs at different sites and time points for implantation. Results The transplanted NSCs lived for at least 8 weeks, which showed no relation with the transplanted site. Intraventricular infarcted NSCs migrated to the ischemic region, and the migration tendency was more significant in the 24-hour group than in the 4-week group. Conclusion NSCs from rat embryonic can live for a long period and migrate widely after transplantation into the ventricle or central site in the infarcted area in rats, and the migration tendency is related to the transplanted time after ischemia.

　　Key words: stem cell transplantation; reperfusion injury; brain ischemia; rats, Wistar 本实验在大鼠脑缺血急性期 (24 h) 和晚期 (4周) 向脑室内和梗死中心移植胚胎大鼠皮质神经干细胞，观察脑缺血时间窗和局部微环境对移植细胞存活、增殖和迁移的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 Neurobasal培养液、B27添加剂、5-溴脱氧尿嘧啶 (Brdu，Gibco公司)，碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF，Sigma公司)，抗Brdu单抗、抗大鼠nestin单抗、抗大鼠胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 单抗、抗大鼠神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 单抗 (晶美公司) 均以1∶400稀释;DAB免疫组化试剂盒 (中山)，多聚赖氨酸 (迈新)。DY-Ⅱ型动物用立体定向仪。

　　1.2 细胞培养 取胎龄8~10 d的Wistar胎鼠，切开脑组织，去除硬脑膜，机械剪切吹打后经80目滤网过滤成单细胞悬液，Hanks液冲洗3次，1 000 r/m离心5 min后弃上清。神经干细胞培养液 (Neurobasal培养液以体积比20∶1加入B27添加剂、青霉素100 μg/ml、链霉素100 μg/ml，bFGF 20 ng/ml、EGF 20 ng/ml) 重悬细胞，细胞计数后以1 × 106个/ml种植于25 ml培养瓶中，置于含5% CO2培养箱37 ℃常规培养，3~4 d换液1次，7~10 d传代1次。

　　1.3 动物模型 健康成年雄性Wistar大鼠，体质量 (280 ± 20) g，10%水合氯醛按0.4 g/kg腹腔注射麻醉，Longa线栓法制作右侧大脑中动脉局灶性脑缺血 (MCAO) 模型。

　　1.4 免疫细胞化学染色 细胞传至第5代时将细胞移植于经多聚赖氨酸处理的培养板中，培养液为含10%胎牛血清的DMEM/F12，培养6~7 d后丙酮固定，0.1% TritonX-100处理，相应一抗4 ℃孵育过夜，PBS冲洗后与生物化二抗在37 ℃下孵育1 h，DAB染色，苏木素复染后封片。

　　1.5 细胞标记和移植 细胞传至第5代3 d后，更换培养液，在神经干细胞培养液中加入Brdu至终浓度10 μg/ml，待神经球再次形成时，收集并吹打使之分离，离心后弃上清待用。将MCAO大鼠固定于脑立体定向仪上，双侧耳棒刻度相同，齿棒在水平线下方2 mm，常规备皮消毒，头部正中切开头皮，暴露前囟。侧脑室注射点为前囟向尾侧0.8 mm，中线偏外侧1.2 mm，注入深度3.0 mm。将神经干细胞5 × 106个溶于5 μl PBS，用微量注射器10 min注完，注毕留针5 min，术毕骨蜡封闭骨窗，逐层缝合。

　　1.6 实验动物分组 取MCAO闭塞大鼠40只，随机等分成A~D 4组，A组为梗死后24 h脑室内移植组，B组为梗死后24 h梗死中心移植组，C组为梗死后4周脑室内移植组，D组为梗死后4周梗死中心移植组;各实验组均设仅移植生理盐水的空白对照组。细胞移植8周后处死各组大鼠，行Brdu染色，观察不同部位、不同时间移植细胞的存活和迁移情况。

　　2 结 果

　　2.1 神经干细胞体外培养增殖和鉴定 原代细胞均为小圆形细胞，接种后6 d可见大部分细胞死亡，少量残余细胞分裂、增殖形成球形细胞团，悬浮生长，即神经球 (图1)。原代细胞培养10 d后，将神经球机械分离，重新制成单细胞悬液并计数后传代，7~10 d可见次代神经球形成。目前已传至20代，免疫组化染色见神经球内大部分细胞核Brdu阳性，细胞质nestin阳性 (图2)。将该神经球分离后用含血清的培养液诱导，可见大量胶质细胞和神经元样细胞从神经球内迁移出来，排列在神经球周围，呈太阳状，免疫染色见部分细胞表达GFAP，部分细胞表达NSE。

　　2.2 神经干细胞体内移植结果 A组可见移植细胞大量存活，穿过室管膜向脑组织迁移，特别是向缺血周边区迁移，许多Brdu阳性细胞聚集，推测为移植干细胞进一步分裂、增殖的结果，移植细胞与宿主细胞相容良好，彼此整合，未见明显排斥反应 (图3)。B组细胞主要聚集于梗死中心移植区域，大量细胞存活，充填梗死区，少量细胞穿过胼胝体向健侧迁移 (图4)。C组仅见少量Brdu阳性细胞存活，细胞增殖、分裂较A组不明显，且存活细胞主要在移植部位，极少数穿过室管膜细胞向脑实质迁移，细胞迁移没有明显的定向性，较均匀地向皮质迁移。D组存活移植细胞较B组明显减少。

　　3 讨 论

　　神经干细胞移植治疗脑缺血性损伤，不仅要达到移植细胞可长期存活的目的，更重要的是移植细胞可与宿主健存的细胞发生突触联系而达到功能恢复[1]。Miyata等[2]采用单层培养方法动态观察神经干细胞的分裂和迁移，发现位于室管膜或软脑膜上的神经干细胞在迁移中与软脑膜相连的突起始终与软脑膜相连，随着迁移该突起也不断延长;当这些细胞分裂时，该突起被两个子细胞继承。本实验将细胞植入脑室和脑梗死灶中心，目的在于比较不同微环境对移植细胞存活的影响。Brustle等[3]将体外培养的人类神经干细胞移植入大鼠胚胎的脑室，发现移植细胞可穿过室管膜而与宿主神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞广泛整合，与本实验的观察结果一致。

　　脑缺血可以诱导脑内，尤其是缺血周边区脑源性生长因子 (BDNF)、胶质细胞源性生长因子 (GDNF)、神经生长因子 (NGF)、bFGF、转化生长因子β1 (TGF β1) 等神经营养因子的表达[4～7]。本实验发现：MCAO后移植的Brdu阳性神经干细胞向缺血周边区迁移明显，特别是缺血24 h后移植的细胞，其存活率、增殖程度和定向迁移均较晚期移植组更加明显，而这一时间窗恰好与这些细胞因子的分泌高峰相吻合。因此，营养因子和趋化因子在脑缺血24 h分泌较多可能对移植细胞的存活、增殖和迁移起重要作用。本实验脑缺血大鼠脑室内移植组和梗死中心移植组存活细胞数量没有显著性差异，说明两处微环境对细胞增殖作用相当，与文献报道不同，关于微环境对移植细胞的分化影响仍需进一步研究。另外，本实验还观察到梗死中心的移植细胞中有少量细胞穿过胼胝体向健侧迁移，说明局灶性脑缺血对全脑产生了影响。

　　胎脑原代神经细胞移植由于其急性免疫排斥反应而使移植物中的前体细胞不能良好存活;而移植物中的成熟神经元又因不能与周围神经组织建立良好的连接，缺少神经营养因子和神经介质的作用而不能长期存活。文献报道，人原代神经细胞移植入恒河猴后8周可见移植细胞几乎全部死亡[8]。本实验移植的神经干细胞8周后仅少量存活，且向脑组织迁移程度明显降低，但与宿主神经细胞整合良好，且在移植部位周围没有出现明显胶质增生和炎症细胞浸润。

　　然而，本实验仅能证明神经干细胞在脑缺血急性期 (24 h) 和晚期 (4周) 移植后的存活情况，其在脑内增殖的具体机制，移植的最佳时间窗，移植细胞的分化情况，与宿主细胞能否形成的突触连接能否恢复功能等，仍需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 杨东波, 杨立庄, 李永利, 等. 大鼠局灶性脑缺血后神经前体细胞增殖迁移的研究 [J]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2003; 8(10): 463-466.

　　[2] Miyata T, Kawaguchi A, Saito K, et al. Visualization of cell cycling by an improvement in slice culture methods [J]. J Neurosci Res, 2002; 69(6): 861-868.

　　[3] Brustle O, Choudhary K, Karram K, et al. Chimeric brains generated by intraventricular transplantation of fetal human brain cells into embryonic rats [J]. Nat Biotechnol, 1998; 16(11): 1040-1044.

　　[4] Schwartz ED, Chin CL, Shumsky JS, et al. Apparent diffusion coefficients in spinal cord transplants and surrounding white matter correlate with degree of axonal dieback after injury in rats [J]. Am J Neuroradiol, 2005; 26(1): 7-18.

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　　[6] Song BW, Vinters HV, Wu D, et al. Enhanced neuroprotective effects of basic fibroblast growth factor in regional brain ischemia after conjugation to a blood-brain barrier delivery vector [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2002; 301(2): 605-

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　　[8] 黄纲雄, 陈碧芬, 陈锦锋, 等. 恒河猴脑内人胚神经细胞移植的实验研究 [J]. 中华实验外科杂志, 2001; 18(1): 90.