嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究

　　作者：傅佳峰，叶盛，朱丹化，曾博，张宇，诸葛启钏 作者单位：温州医学院附属第一医院 神经外科，浙江 温州 325000

　　【摘要】 目的: 嗅鞘细胞移植入大鼠脑出血模型后，观察偏瘫大鼠功能恢复以及移植细胞后30 d内的形态学变化。方法：差速贴壁法培养出高纯度的嗅鞘细胞，制作38只大鼠脑出血模型，分三组：第1组10只为空白组，第2组10只为HBSS移植组，第3组18只为嗅鞘细胞移植组;三组大鼠分别在术后3 d、7 d、14 d和30 d用forelimb placing方法进行评分，判断嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血模型的作用。结果：hoechst示踪及电镜观察结果，均证实嗅鞘细胞能在大鼠体内存活;对三组大鼠进行评分，嗅鞘细胞移植组的功能恢复明显优于其他两组。结论：从成年大鼠嗅黏膜用差速贴壁法能成功培养出嗅鞘细胞，并用于细胞移植，移植细胞能存活;嗅鞘细胞移植能改善大鼠脑出血后偏瘫肢体的功能。

　　【关键词】 嗅鞘细胞;脑出血;模型，动物;细胞移植

　　Experimental study on olfactory ensheathing cells transplanting to rat cerebral hemorrhage mode FU Jia-feng，YE sheng，ZHU dan-hua，ZENG Bo，ZHANG Yu，ZHUGE Qi-chuan. Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To transplant the successfully cultured olfactory ensheathing cells to rat cerebral hemorrhage mode and to observe the neurological repair function of OECs and the shape of cells in hematoma and brain tissue of 30 days. Methods: High purification of olfactory ensheathing cells using the method of the differing rates in attachment of the various cells type was cultured. Thirty-eight rats of cerebral hemorrhage mode were established and divided into 3 groups ;the first group (10 rats) was the blank group ;the second group (10 rats) the HBSS transplanting group;the third group (18 rats) the OECs transplanting group. The three groups were all scored in 3 days，7 days， 14 days and 30 days after operation by forelimb placing method. The contribution of OECs transplanton for curing rat cerebral hemorrhage with statistics method was eraluated. Results: OECs were comfirmed alive by immunofluorescence frace method and electron microscope;after scoring the three groups by forelimb placing method and calculating them， Olfactory ensheathing cells injected significantly reduced motor deficits compared with the control groups after cerebral hemorrhage (P <0.05). Conclusion: OECs can be successfully cultrued using the method of the differing rates of attachment of the various cells type from adult mouse olfactory mucosa and can be used for cell transplanting ;OECs transplanting method is a method of curing rat cerebral hemorrhage.

　　Key words: olfactory ensheathing cells;cerebral hemorrhage;modes;animal;cell transplantation

　　脑出血疾病在我国是一种危害人民健康的疾病，在脑血管疾病中当属最严重的一种，虽然其发病率只占其中的20%左右，但其病残、死亡率都很高，是老年人死亡的首要原因[1]。神经干细胞方面研究取得的成功，使神经干细胞移植治疗脑出血成为了研究热点，但神经干细胞也有其自身的缺点，比如，取材困难，存在伦理方面的问题，因此，有一种新的细胞引起了人们的注意，这就是嗅鞘细胞，嗅鞘细胞不仅有神经干细胞的特点，还有其自身的优点，如取材方便，从嗅黏膜即可获得嗅鞘细胞，能够避免伦理问题。笔者尝试用嗅鞘细胞移植来治疗大鼠脑出血，希望能为下一步的临床研究积累经验。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 雌性SD大鼠(250～300 g，由温州医学院动物实验中心提供)，DME/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、VI型胶原酶、HBSS液、P75 NGFR、GFAP、FITC标记的羊抗小鼠IgG、hoechst均由GIBCO公司提供，LEICA解剖显微镜，LEICA倒置相差显微镜，水平离心机为beckman公司的Avanti J-20 XP，荧光显微镜为Olympus公司产品，大鼠立体定向仪。

　　1.2 方法

　　1.2.1 嗅鞘细胞的原代培养及鉴定：参照改良的Nash差速贴壁法[2]进行培养：大鼠麻醉(水合氯醛，4 ml/100 g)后断首，在75%酒精中浸泡5 min消毒，去除额骨和鼻骨，获得嗅黏膜后，放于盛有HBSS液的培养皿。培养皿均放置于冰块上降温，在LEICA解剖显微镜下严格无菌操作取嗅黏膜固有层，剪刀剪碎至大约1 mm2小块，用0.25胰蛋白酶在37 ℃孵箱中消化15 min左右，再用含10%胎牛血清的培养液终止消化，机械轻柔吹打20次，在水平离心机中以200 r/min离心6 min，去除上清液，留沉淀物，加入含10%胎牛血清的DME/F12培养液，37 ℃，5% CO2孵箱中培养。细胞培养72 h后成纤维细胞及星形胶质细胞大部分贴壁生长，轻轻晃动培养瓶，将悬浮细胞液吸出，将该培养液400 g离心4 min，去除上清液，留沉淀物，加入新的培养液，以5×105/ml细胞密度接种于多聚赖氨酸包被的放有载玻片的6孔培养板中，37 ℃，5% CO2条件下培养3 d后，大部分嗅鞘细胞贴壁生长。以后根据情况36～48 h换培养液。

　　免疫荧光鉴定: P75与hoechst双染。用明视野和相差显微镜观察，随机选取5个视野计数阳性细胞数并计算平均阳性百分率。

　　1.2.2 大鼠脑出血模型的制作：38只体重250～300 g的SD大鼠随机分成三组：第1组10只为空白组，第2组10只为HBSS移植组，第3组18只为嗅鞘细胞移植组(其中4只在移植细胞中标记hoechst，观察细胞在大鼠体内生长情况，4只用于电镜观察细胞移植后的超微结构)。模型制作参照Hua等[3]的方法。

　　1.2.3 Hoechst33342标记OECs：Hoechst33342染料是双间二氮茚类物质，其可逆结合于细胞中富含A-T的染色体区域，在紫外光激发下产生黄绿色荧光。离心收集好的细胞里加入新鲜D/F12培养基3～4 ml，移液管反复吹打形成细胞悬液，加入核荧光标记物Hoechst，使之作用浓度为10 μg/ml，迅速晃动混匀后移入37 ℃ CO2孵育箱中孵育15 min，取少量悬液进行台盼蓝活细胞计数，离心去上清，用HBSS液悬浮细胞，调整终浓度为4×104/μl备用。

　　1.2.4 立体定向细胞移植：移植OECs细胞悬液的制备:用0.25%胰酶消化OECs后，反复1 0OO r/min离心6 min，用细胞计数板计数细胞浓度为4×104/μl，以HBSS液悬浮细胞。

　　在制作大鼠脑出血模型后的第3天，注射麻醉，将其置于立体定向架上。碘伏消毒后，沿中线切开缝合线，暴露颅骨。按照实验分组，第2组在立体定向下引导微量注射器向大鼠脑组织尾状核内匀速注射(10 min)10μl HBSS，第3组注射由HBSS悬浮的嗅鞘细胞10μl(细胞浓度为4×104/μl)，其中4只大鼠的嗅鞘细胞标记Hoechst，注射部位为原手术入口，即前囟右旁3.0 mm，进针深度为6.0 mm，当注射5μl左右，将微量注射器提高2.O mm继续注射5μl，注射时间上下部位各5 min，再分别上下部位各停针5 min后缓慢拔出注射器，3% H2O2清洗创面缝合头皮后，碘酒消毒伤口。

　　1.2.5 神经功能评分：forelimb placing[3]评分方法：实验人员控制住大鼠的后肢及一侧前爪，使另一侧前爪能自由活动，用能活动侧前爪的触须碰桌沿，共10次，记录前爪能抓桌沿的次数，1次1分，最高10分。细胞移植后3 d、7 d、14 d和30 d分别进行forelimb placing功能评价。

　　1.3 统计学处理方法 采用单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 免疫荧光鉴定及纯度计算 免疫荧光鉴定：P75具有特异性，本实验行嗅鞘细胞的P75和hoechst免疫荧光双染。嗅鞘细胞根据形态分为梭形细胞、双极细胞、三极细胞、多极细胞及连接成网状的细胞(见图1、图2)。

　　纯度计算：对培养7 d、14 d和21 d的细胞分别进行纯度计算，各个时间的嗅鞘细胞的纯度是不一样的，培养7 d时嗅鞘细胞的纯度最高，可达80%，以后逐渐下降，14 d纯度为70%，21 d细胞纯度仅为50%。文献报道称嗅鞘细胞比例达50%就可以进行细胞移植[4]，故本实验培养的细胞符合细胞移植的要求。

　　2.2 Hoechst33342 OECs观察 将移植Hoechst标记嗅鞘细胞的大鼠常规灌注，制作冰冻切片。荧光显微镜观察可见大量草绿色Hoechst标记的细胞核，证实Hoechst33342标记OECs在大鼠体内存活，细胞从注射部位向上下迁移并分布于血肿带的附近。分别见图3、图4。

　　2.3 电镜观察 分别将正常大鼠、脑出血模型制作后的大鼠和移植嗅鞘细胞后3 d、7 d、14 d和30 d的大鼠各1只予常规灌注，根据立体定向的方法，取出注射嗅鞘细胞处的尾状核脑组织，送电镜室切片观察，通过对正常脑组织、脑出血后的脑组织、移植细胞后不同时间段的脑组织的比较，观察脑组织超微结构的变化。嗅鞘细胞内有丰富的线粒体、游离核糖体及粗面内质网，细胞质深，细胞核不规则，常染色质为主、核仁编织状，可见神经微丝，新生的髓鞘较薄、神经丝少，有突触联结，突触囊泡成圆形，周边有红细胞，大堆红细胞被新生的嗅鞘细胞包围，髓鞘边缘有小的囊泡、脂质样颗粒，移植区内毛细血管丰富(见图5、图6)。

　　2.4 三组间神经功能评分比较 在神经功能恢复情况中，空白组和HBSS组在术后30 d的神经功能缺损评分较术后3 d显著降低，差异有显著性(P<0.05)，说明对照组也存在自我修复的能力。OECs移植组在术后14 d的评分即有明显降低，差异有显著性(P<0.05)，OECs移植能促进受损组织修复，改善脑出血大鼠的神经功能。见表1。

　　3 讨论

　　中枢神经系统损伤与再生研究是当今神经科学领域的热点，在众多研究方法之中，细胞移植为一种理想的研究手段，选择的移植材料是否理想，直接关系到神经再生及其功能恢复[5]。近年来和嗅鞘细胞已被广泛应用于实验研究并且获得了良好的效果。Agrawal等[6]通过实验证实嗅鞘细胞移植治疗大鼠Parkinson’s疾病是有效的。Jike等[7]做了大量关于嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤方面的研究，获得了一定的成功。国内的黄红云等[8-9]已经将胚胎的嗅鞘细胞经纯化、培养后移植到脊髓受损的晚期患者，结果发现，在排除脊髓减压作用的可能性后，嗅鞘细胞移植后，患者的脊髓神经功能均有不同程度的改善。国内唐洲平等[10]在嗅鞘细胞移植治疗脑出血方面已做了大量有意义的工作。上述学者在细胞移植治疗动物中枢神经损伤方面所取得的成果是令人鼓舞的。通过本实验的研究发现，嗅鞘细胞同神经干细胞一样，能改善大鼠脑出血后的神经功能缺损。

　　嗅鞘细胞移植用于治疗神经损伤有较大的优越性，这主要表现在以下几个方面[11]:嗅鞘细胞具有较强的神经细胞保护作用;具有较强的促进轴索生长的作用;具有引导新生轴索通过胶质疤痕和PNS-CNS移行区的作用;能有效促进突触形成的作用;可从自体嗅黏膜取材应用，且无损伤性;避免伦理问题;有较强的成髓鞘作用;可作为基因治疗的载体细胞。

　　大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的成功培养以及治疗脑出血的显著疗效使我们看到了嗅鞘细胞临床移植治疗脑出血的前景。从嗅黏膜获得嗅鞘细胞不仅方法简单，还能够避免伦理问题。本实验的成功，能为下一步培养人嗅黏膜嗅鞘细胞并应用于临床积累丰富的经验。

　　【参考文献】

　　[1] Lo YK, Yiu CH, Hu HH, et a1. Frequency and characteristicsof early seizures in Chinese acute stroke[J]. Acta Neurol Scand,1994,90(2):83-85.

　　[2] Nash HH, Borke RC, Anders JJ. New Method of Purificationfor Establishing Primary Cultures of Ensheathing Cells From the Adult Olfactory Bulb[J]. Glia, 2001, 34(2):81-87.

　　[3] Hua Y, Schallert T, Keep RF,et al. Behavioral Tests AfterIntracerebral Hemorrhage in the Rat[J]. Stroke,2002, 33(10):2478-2484.

　　[4] Jike Lu, Franc ois Fe抮on, Stephen M Ho.Transplantation ofnasal olfactory tissue promotes partial recovery in paraplegicadult rats[J].Brain Research,2001,899(1?):344-357.

　　[5] Angela Bithell, Brenda P, Williams. Neural stem cells and cellreplacement therapy: making the right cells[J]. Clin Sci ,2005,108(1): 13-22.

　　[6] Agral AK, Shukla S, Chaturvedi RK, et al. Olfactory ensheath-ing cell transplantation restores functional deficits in rat modelof Parkinson抯 disease: a cotransplantation approach withfetal ventral[J].NeurobiolDis,2004,16(3):516-526.

　　[7] Jike Lu, Franc, Ois Fe抮on,et a1.Olfactoryensheathing cellspromote locomotor recovery after delayed transplantationinto transected spinal cord[J]. Brain,2002, 125 (Pt 1):14-21.

　　[8] 黄红云.嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的基础与临床研究[J].中国临床康复,2002(14)：2027-2028.

　　[9] 黄红云, 王洪美, 修波,等. 嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤临床实验的初步报告[J]. 海军总医院学报, 2002, 15(1):18-21.

　　[10]唐洲平, 郭守刚, 康慧聪,等. 嗅鞘细胞移植治疗脑出血的实验研究[J]. 中国现代医学杂志,2005, 15(11):1028-1031.

　　[11]傅佳峰, 诸葛启钏, 周盛轩,等. 成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分离、培养、鉴定及纯化[J]. 温州医学院学报,2007,37(1):21-23.