实验性蛛网膜下腔出血对脑微血管内皮细胞的作用研究

　　作者：陈志，吴南，李飞，唐卫华，邢学民，冯华 　(第三军医大学西南医院神经外科，重庆 400038)

　　摘要: 目的 建立实验性蛛网膜下腔出血后内皮细胞损伤模型，并观察血性脑脊液(bloody cerebralspi-nal fluid，BCSF)对培养的微血管内皮细胞的损害作用。 方法 将体外培养的兔脑微血管内皮细胞分为对照组和BCSF刺激组，通过MTT比色法选择恰当孵育时间的BCSF作为刺激因素，观察病理形态学改变、细胞计数、流式细胞术细胞周期，分析评估内皮细胞损害和增殖状况。 结果 与对照组比较，孵育7天BCSF可使内皮细胞出现明显的病理形态学改变，贴壁细胞数量减少，MTT吸光度下降(P<0.01)，G 0 ～G 1 期细胞比例增高(P<0.01)。 结论 BCSF可直接造成明显的兔脑微血管内皮细胞病理形态学损害，并抑制血管内皮细胞代谢和增殖。

　　关键词: 脑血管痉挛;蛛网膜下腔出血;内皮细胞;兔

　　Effect of experimental subarachnoid hemorrhage on microvessel endothelial cells of brain

　　CHEN Zhi，WUNan，LI Fei，et al.

　　(Departments of Neurosurgery，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)

　　Abstract: Objective To establish an endothelial cell model in vitro following experimental subarachnoid hemor-rhage，and study the cytoxic effect of bloody cerebrospinal fluid(BCSF)on endothelial cells.Methods Rabbit brain mi-crovessel endothelial cells(BmvECs)were divided into a control group and a BCSF group.MTT assay was taken to evalu-ate the injury of BCSF incubated for different time on BmvECs in order to decide the suitable BCSF as pathogen.Morpho-logical changes，cell counting，MTT assay，flow cytometric analysis were used to evaluate the cytoxic effects on BmvECs.Results BCSF could cause severe morphologic changes in BmvECs and decreased MTT assay，and increased cell propor-tion of G 0 -G 1 of BmvECs(P<0.01).Conclusion BCSF could cause direct injury on endothelial cells，including mor-phological changes and decreased proliferation.

　　Key words:cerebral vasospasm;subarachnoid hemorrhage;endothelial cells;rabbits

　　出血性脑血管疾病继发或颅脑创伤后蛛网膜下腔出血(SAH)诱发的慢性脑血管痉挛(chronic cerebral vasospasm，CVS)是SAH致死或致残的主要原因，严重影响原发疾病的预后。CVS发生的病因和机制研究已持续了数十年，至今尚未完全阐明。大量研究已证实血管内皮细胞的损害在CVS发生发展中起到十分重要的作用，因此，血管内皮细胞的损害机制及保护是CVS防治研究的关键环节之一。本研究采用体外孵育的兔血性脑脊液(bloody cerebralspinal fluid，BCSF)模拟SAH刺激因素作用培养的兔脑微血管内皮细胞(brain microvessel endothelial cells，BmvECs)，观察BCSF对内皮细胞病理形态学、增殖改变的影响，为建立CVS内皮细胞损伤模型及后续研究提供依据。

　　材料与方法

　　1 兔脑微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定

　　8～12周大小的New Zealand白兔麻醉后颈动脉放血法处死，断头颅去皮后浸入75%的乙醇中消毒约1分钟，无菌状态下取出兔脑，分离出大脑皮质，按匀浆后筛网过滤法分离培养兔脑微血管内皮细胞;Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色鉴定脑微血管内皮细胞。

　　2 人工血性脑脊液的制备[1]

　　无菌条件下取正常人血液与配制人工脑脊液，并按1:1比例混合;将其置于37℃水浴温箱中孵育7天后将样品取出离心(10100g，20分钟)，留取上清液4℃贮存备用;使用前，将上述离心上清液与DMEM培养基按2:1的比例配制，即得到本研究中采用的血性脑脊液。

　　3 不同孵育时间BCSF对内皮细胞活力的影响

　　将传代细胞分别接种于培养板或培养瓶培养至近汇合为单层，更换无血清培养基培养24小时，将细胞随机分为正常对照组(Control)、不同孵育天数的BCSF刺激组(BCSF1、BCSF3、BCSF5、BCSF7、BCSF9、BCSF12)。正常对照组加入无血清培养液，BCSF刺激组分别加入BCSF1、BCSF3、BCSF5、BCSF7、BCSF9、BCSF12。按上述分组以每孔1×10 4 个细胞接种于96孔板中，37℃、5%CO 2 孵箱内静置培养，24小时后按分组处理;24小时后取出96孔板，每孔加入MTT溶液(5mg.ml)20μl后，继续37℃、5%CO 2 孵箱内静置培养4小时后终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl二甲亚砜，振荡10分钟;选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。

　　4 实验细胞分组

　　将传代细胞分别接种于培养板或培养瓶培养至近汇合为单层，更换无血清培养基培养24小时。根据上步的实验结果选择适当孵育天数的BCSF作为刺激因素，将细胞随机分为正常对照组(Control)、BCSF刺激组(BCSF)。

　　5 形态学观察

　　倒置显微镜形态观察各组实验细胞的生长状况及细胞形态，连续3天;实验细胞分组处理24小时后，用细胞刮将其刮下离心，3%戊二醛固定，1%四氧化锇后固定，常规包埋、切片、电子染色后2000EX透射电镜观察。

　　6 内皮细胞增殖测定

　　(1)细胞计数:按上述分组将传代细胞接种于24孔培养板，处理结束后消化收集细胞，血球计数板计数。(2)流式细胞术细胞周期分析:按文献报道方法将各组细胞制成悬液后，加入PI至终浓度为50μg.ml进行荧光染色(避光，冰浴30分钟)，4小时内上机检测细胞各周期的细胞数及占总细胞数的百分比。每个样品检测10000个细胞，计算G0.G1期、S期、G2.M期的细胞数及比例。

　　7 统计学方法

　　实验数据输入SPSS10.0统计软件，进行描述性分析，数据以ˉx±s表示，采用单向方差分析(One-way ANOVA)，继以Newman-Keuls检验两两比较，取P<0.05为差异具有显著性水平。

　　结果

　　1 不同孵育时间BCSF对BmvECs细胞活力影响

　　孵育1～12天的BCSF均可导致内皮细胞MTT反应光吸收值降低，与对照组比较差异具有显著性。7天以后，MTT光吸收值降低趋势减缓，BCSF7组与BCSF5组差异具有显著性(P<0.01)，而BCSF9、BCSF12与BCSF7差异不具有显著性(P>0.05)，故采用孵育7天的BCSF作为下一步实验刺激因素(见图1)。

　　2 血性脑脊液对内皮细胞的形态学影响

　　倒置显微镜下见正常对照组细胞紧密排列生长，融合成单层，细胞间界限清楚，呈典型的“铺路石”外观。BCSF损伤后1天细胞间隙增宽，胞浆内出现空泡及颗粒，2天时可见细胞明显收缩变形，细胞脱壁，3天后仅少数细胞残余(见图2)。

　　透射电镜下见正常对照组细胞，胞质细胞器丰富，相邻内皮细胞间有紧密连接，未见Weibel-Palade小体。BCSF损伤后1天见细胞内线粒体和内质网肿胀，大量髓鞘样结构形成，并可见局灶性溶解(见图3)。BCSF组2天以后多数细胞均已脱壁，残余细胞少，未送电镜检查。

　　图1 不同孵育时间BCSF对内皮细胞活力的影响(略)

　　图2A 血性脑脊液作用后1天 (略)

　　图2B 血性脑脊液作用后2天(略)

　　图2C 血性脑脊液作用后3天(略)

　　图2 血性脑脊液对脑微血管内皮细胞的损伤(倒置显微镜×100)(略)

　　图3 血性脑脊液作用后1天的脑微血管内皮细胞(EM×6000)(略)

　　3 血性脑脊液对内皮细胞的增殖影响

　　3.1 细胞计数 如表1、图2所示，BCSF组随处理天数严重，贴壁细胞数量急剧减少，至第3天时大部分细胞已脱壁。

　　3.2 如表2所示，BCSF组细胞G 0 ～G 1 期比例增高(P<0.01)，G 2 ～M期比例下降(P<0.01)，细胞进入G 2 ～M期受抑，停留于S期。

　　表1 BCSF刺激后贴壁内皮细胞计数(略)

　　与对照组比较:* P<0.01

　　表2 BCSF对内皮细胞周期的影响(略)

　　与对照组比较:* P<0.01

　　讨论

　　慢性脑血管痉挛的发病机制是多因素和多途径的病理过程，关于其病理基础也存在较大争议，但大量研究均认为血管内皮细胞损害在CVS的发生、发展具有重要作用。在大量SAH患者尸检和实验性SAH动物模型研究中均发现痉挛血管内皮细胞存在明显的病理改变[1-3] ，但目前对SAH后血管内皮细胞的损伤机制尚不十分明确[4] 。在体内研究中，内皮细胞的损害一方面可能由蛛网膜下腔积血及分解产物所引起的毒性所致，另一方面，痉挛的血管持续强烈地收缩也可继发内皮细胞的机械损伤，两者作用难以区分。采用离体实验能避免在体实验的诸多干扰因素和动物模型的差异，有助于明确SAH后内皮细胞改变的病因和机制。

　　体外孵育的血性脑脊液和氧合血红蛋白是SAH离体实验中常用的两类刺激因素[5] 。上世纪90年代，临床及实验证据已经把CVS的严重程度与蛛网膜下腔积血中的氧合血红蛋白联系起来，大量的体外实验研究开始采用氧合血红蛋白作为SAH的刺激因素。近年来，关于氧合血红蛋白对体外培养的内皮细胞损害研究结果[6] 引起了部分学者的质疑，其某些损害可能缘于不纯净的氧合血红蛋白商品中残存的杂质，如LPS或膜抗原等，而高度纯净的血红蛋白可用于临床，并不会对血管内皮细胞造成上述损害[7，8] ，可能的解释是红细胞裂解产物中的其它成分与氧合血红蛋白在CVS的发生、发展中具有协同作用[6] 。因此采用体外孵育的血性脑脊液作为致病因素可能更接近SAH后的病理状态。本研究通过MTT实验选择孵育7天的BCSF作为后续实验的刺激因素，更长孵化时间的BCSF对内皮的MTT活力仅稍强BCSF7，这也与临床上SAH后CVS的发展规律以及氧合血红蛋白代谢时程基本符合，适合于CVS的相关体外研究。

　　Findlay等[1] 在猴SAH模型中观察到血管内皮细胞出现明显的超微病理损害表现，如细胞变性、空泡形成、细胞间隙增宽和细胞间紧密断裂等，并可导致内皮细胞脱落。我们在前期大鼠SAH模型中也可观察到类似表现，此外还在早期即观察到平滑肌、肌膜及内皮细胞形成丘状隆起现象[2] 。Foley等[9] 首先观察了体外孵育的血性脑脊液对牛大脑中动脉内皮细胞的毒性作用，BCSF作用的内皮细胞发生了光镜下形态改变和蛋白质合成下降，随着孵化时间的延长，BCSF的细胞毒性亦加强。研究认为血凝块溶解时释放出的血红蛋白对内皮细胞产生了直接病理损害。对SAH所致离体内皮细胞的超微病理损害报道不多，本实验发现BCSF所致的内皮超微病理表现主要有线粒体肿胀、内质网扩张、膜性结构“髓鞘”样改变以及局灶性胞浆溶解等，与在体研究中内皮细胞超微病理改变有类似之处。同时，细胞计数、MTT和流式细胞术周期分析研究显示，BCSF对血管内皮细胞代谢和增殖具有明显的抑制作用。

　　本实验中通过体外孵育的血性脑脊液作用脑微血管内皮细胞，建立脑血管痉挛的内皮细胞损伤模型，并观察了内皮细胞的病理、代谢和增殖变化，结果显示，血性脑脊液可直接造成明显的血管内皮细胞病理形态学损害，并对血管内皮细胞代谢和增殖具有明显的抑制作用，提示减轻SAH后内皮细胞的损害、促进内皮细胞代谢可能是CVS治疗策略中的重要环节，SAH后内皮细胞损害分子机制仍不十分明确，相关的药物干预研究也较少，均有待进一步研究。

　　参考文献:

　　[1] Findlay JM，Weir BK，Kanamaru K，et al.Arterial wall changes in cerebral vasospasm[J].Neurosurgery，1989，25(5):736-745;discussion745-746.

　　[2]代佳平，冯华，刘昕，等.大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛模型的制备[J].第三军医大学学报，2000，22(3):295-297.

　　[3] Zubkov AY，Tibbs RE，Clower B，et al.Morphological changes of cerebral arteries in a canine double hemorrhage model[J].Neurosci Lett，2002，326(2):137-141.

　　[4] Park KW，Metais C，Dai HB，et al.Microvascular endothelial dysfunction and its mechanism in a rat model of subarachnoid hemorrhage[J].Anesth Analg，2001，92(4):990-998.

　　[5] Zubkov AY，Rollins KS，McGehee B，et al.Relaxant effect of U0126in hemolysate，oxyhemoglobin，and bloody cerebrospinal fluid-induced contraction in rabbit basilar artery[J].Stroke，2001，32(1):154-161.

　　[6] Ogihara K，Zubkov AY，Bernanke DH，et al.Oxyhemoglobin-in-duced apoptosis in cultured endothelial cells[J].J Neurosurg，1999，91(3):459-465;Comment in:J Neurosurg，2000，92(5):899-902.

　　[7] D'Agnillo F，Wood F，Porras C，et al.Effects of hypoxia and glutathione depletion on hemoglobin and myoglobin-mediated oxidative stress toward endothelium[J].Biochim Biophys Acta，2000，1495(2):150-159.

　　[8] Goldman DW，Breyer RJⅢ，Yeh D，et al.Acellular hemoglo-bin-mediated oxidative stress toward endothelium:a role for fer-ryl iron[J].J Physiol(Am)，1998，275:1046-1053.

　　[9] Foley PL，Takenaka K，Kassell NF，et al.Cytotoxic effects of bloody cerebrospinal fluid on cerebral endothelial cells in cul-ture[J].J Neurosurg，1994，81(1):87-92.