黄体酮对鼠脑外伤后脑组织炎性信号因子表达的干预作用

　　作者：沈斌，杭春华 作者单位：南京市六合区人民医院脑科，江苏 南京 211500

　　【摘要】 目的 观察黄体酮对脑外伤后脑组织内炎症反应信号转导因子核因子κB(NFκB)、炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNFα)和白介素1β(IL1β)水平的影响，探讨其对创伤性脑外伤(TBI)继发性脑损伤的保护作用及可能的作用机制。方法 采用Freeney法造成大鼠脑挫裂伤模型，在伤后1、3、5、7天不同时相点用ELISA法、免疫组化法分别检测4组大鼠脑组织中NFκB、TNFα、IL1β水平的变化。结果 伤后注射黄体酮治疗组脑组织NFκB、TNFα、IL1β 3种炎性因子水平均比脑创伤组低(P<0.05)。结论 注射黄体酮能降低脑外伤后炎性信号因子表达，减轻脑外伤后脑组织的炎症反应，对脑组织起一定的保护作用。

　　【关键词】 颅脑损伤;核因子κB;肿瘤坏死因子;白介素1β;炎症;黄体酮

　　Effect of progesterone administration on expression of the inflammatory factors after brain injury in rats

　　SHEN Bin,HANG Chunhua

　　(Department of Neurosurgery,Liuhe People's Hospital,Nanjing 211500,China)

　　Abstract： Objective To observe the influence of progesterone administration on expression of the inflammatory factors such as nuclear factorkappa B(NFκB),tumor necrosis factorα (TNFα) and interleukin1β(IL1β) following traumatic brain injury and to explore the possible mechanisms for its neuroprotective effects.Methods Parietal brain contusion was adopted using Freeney's weightdropping method.The levels of NFκB,TNFα and IL1β expression in brain tissues were detected by ELISA or immunohistochemistry at each corresponding time point.Results The result showed a persistent upregulation of NFκB,TNFα,IL1β in the area surrounding the injured brain.The level of inflammatory factors expression and the number of neurocyte apoptosis can be decreased by injections of progesterone(P<0.05).Conclusion Progesterone administration can down-regulate the expression of the inflammatory factors,alleviate the inflammatory response after TBI and protect brain tissues effectively.

　　Key words:brain injury;inflammatory factors;nuclear factorkappa B;tumor necrosis factorα;interleukin1β;progesterone

　　近年来，创伤性脑外伤(TBI)的发生率不断增高，成为45岁以下个体意外死亡的首要原因[1]。如何减轻TBI的继发性脑损伤成为近年来科学家努力研究的方向。目前普遍认为，TBI后脑组织炎症反应是导致继发性脑损伤的一个重要因素，并且证实炎性信号因子转导因子核因子κB(NFκB)、炎症细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素1β(IL1β)等加重了TBI后继发性脑损伤。作为神经甾体的一员，黄体酮广泛存在于神经系统。已有研究报道[2]动物TBI后，注射黄体酮有抑制脑组织炎症反应的作用。本组试验主要集中在NFκB 、TNFα和IL1β的水平表达方面，研究动物发生TBI并注射黄体酮后3种炎症因子在不同时相内的表达水平变化的影响，证实其在继发性脑损伤的保护作用。

　　材料与方法

　　1 材料

　　雄性Wistar成年大鼠(中科院上海实验动物研究所)，体重200～230g，黄体酮注射液(浙江仙琚制药股份公司，20mg/ml),其溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。

　　2 模型制作、样本采集

　　随机分为4大组，每大组24只。(1)假手术组(sham组)，仅行右侧顶部开骨窗而无脑损伤;(2)TBI组，仅脑部创伤而无治疗;(3)PTBI组，创伤后黄体酮注射治疗;(4)DTBI组，创伤后注射二甲基亚砜(DMSO)。各大组再分为伤后1、3、5、7 天4小组，每小组6只。所有大鼠腹腔予20%乌拉坦(lg/kg)注射麻醉，用牙科钻于大鼠颅骨冠状缝后缘、中线右侧开直径5mm骨窗.保持硬膜完整。按Freeney自由落体撞击致伤方法，造成右顶脑挫裂伤。致伤直径4mm，深度5mm，打击能量1000g/cm2，致重型颅脑损伤。PTBI组0.8ml/kg于伤后1、6、24小时和1、2、3、4、5天腹腔内注射给药，DTBI组在相同时相内注射相应体积的DMSO。4组大鼠分别在伤后1、3、5、7天处死， 快速取全脑，以前囟中心为中心，垂直将脑切成4部分，然后水平切成腹侧和背侧部分。取右后方背侧部分，即是包括损伤区的脑组织。Sham组因1、3、5、7天4天的指标无显著差异，仅留第1天作为对照。

　　3 试剂

　　NFκB免疫组化试剂(一抗，武汉博士德生物工程有限公司)，TNFα、IL1β测定采用ELISA法，TNFα试剂(法国Diaclone公司)，IL1β试剂(比利时Biosource公司)。

　　4 统计学处理

　　所有结果经计算机运用SPSS 12.0统计分析软件进行，每个变量 以均数±标准差(±s)表示，统计学分析用ANOVA(LSD)方差分析及相关性分析，P<0.05 为差异有显著性统计学意义;P<0.01为差异有非常显著性统计学意义。

　　结果

　　1 脑组织NFκB变化

　　NFκB P65阳性细胞表现为棕色细胞核和细胞质，主要参与表达的细胞是血管内皮细胞和神经胶质细胞。Sham组NFκB P65阳性细胞在脑实质细胞中表达率为(17.33±6.43)%(图1a)，TBI组第1天表达为(65.75±17.41)%，与sham组比较增加575%(图1b)，TBI组第3天NFκB p65表达达到高峰为(97.43±7.57)%，与sham组比较增加850%(图1c)，伤后7天仍保持在较高水平(见图1d)。而注射黄体酮后1、3、5、7天组NFκB阳性细胞在神经胶质细胞及血管内皮细胞的表达均被明显抑制(见图1e、f)，注射DSMO(DTBI)无变化。TBI组NFκB p65阳性细胞数在脑实质细胞中百分比，伤后1、3、5、7天比Sham组显著升高(P<0.01);PTBI组脑组织NFκB p65阳性率比TBI组低(P<0.05)，而在DTBI组无显著变化(见图2)。

　　2 脑组织TNFα变化

　　与sham相比，TBI第1天就增高到达高峰(2.68±0.24)pg/mg，以后逐日下降，伤后7天 TNFα水平较伤后第1天明显下降为(1.66±0.27)pg/mg，但仍显著高于sham组(P<0.01)，PTBI组相应时间点脑组织TNFα水平比TBI组显著降低(P<0.05)，而DTBI组无显著变化(见图3)。

　　3 脑组织IL1β变化

　　TBI第1天就增高到达高峰为(17.81±3.16)pg/mg，以后逐日下降，伤后7天 IL1β水平较伤后第1天明显下降，为(10.24±2.56)pg/mg，但仍显著高于sham组(P<0.01)，经黄体酮治疗后各相应时间点IL1β水平明显下降(P<0.05)，而DTBI组无显著变化(见图4)。

　　a.Sham组伤后在血管内皮细胞和胶质细胞无明显阳性表达;b.TBI后1天NFκB P65活性明显增加，可见大量棕色阳性细胞;c.TBI后第3天NFκB P65表达达到高峰;d.TBI第7天NFκB P65仍有明显阳性表达;e.黄体酮治疗后(PTBI)第1天NFκB P65阳性细胞明显较TBI第1天减少;f.黄体酮治疗后(PTBI)第3天NFκB p65表达情况，棕色阳性细胞数明显减少

　　图1 黄体酮对损伤脑组织NFκB的影响(HE× 400)(略)

　　与sham组相比，TBI组NFκB p65水平显著增高：**P<0.01;与TBI组相应时相点相比，PTBI组NFκB p65阳性百分比显著降低：#P<0.05

　　图2sham、TBI、PTBI及DTBI组大鼠伤后脑组织NFκB p65阳性细胞数在脑实质细胞中百分比(略)

　　TBI组TNFα水平显著高于sham组：**P<0.01;与TBI组相比，PTBI第1、3、5、7天组TNFα水平显著降低：#P<0.05

　　图3sham、TBI、PTBI及DTBI组大鼠伤后脑组织TNFα水平(略)

　　TBI组IL1β水平显著高于sham组：**P<0.01;与TBI组相比，PTBI第1、3、5、7天组IL1β水平显著降低：#P<0.05

　　图4sham、TBI、PTBI及DTBI组大鼠伤后脑组织ILβ水平(略)

　　讨论

　　1 NFκB、TNFα、IL1β与TBI后脑组织的炎症反应及继发性脑损伤的关系

　　近年的研究发现，TBI后的炎症反应可能在TBI后继发脑损伤的病理生理过程中起着主导的作用，主要包括炎性信号因子的表达和炎症细胞的浸润。作为炎症反应进程中的上游调控因子，NFκB促进多种炎症细胞因子的基因转录，在炎症细胞因子介导的炎症反应中起重要作用。基因转录增加产生过量的炎症细胞因子,是许多炎症性疾病发生和发展的主要机制。炎症细胞因子是由机体免疫细胞和非免疫细胞分泌,与免疫活化和炎症反应具有重要关系的一类可溶性多肽,正常情况下人体含量极微,在各种因素刺激如感染、外伤后,其表达可急剧增加。TNFα和IL1β、IL6、IL8、IL16是几种主要的促炎症细胞因子。TNFα、IL1β作用于内皮细胞表面表达细胞间黏附分子1(ICAM1) 等物质,促进中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞向血管内皮的黏附使其向炎症区移行。炎症细胞的渗出、浸润加重TBI后脑组织的炎症反应，浸润到脑组织的白细胞释放出炎症介质等,造成脑组织的继发性脑损伤,进一步加重脑水肿。

　　诱生型NFκB 主要由P50和P65 两亚基以同源或异源二聚体形式组成的一组真核细胞转录因子[3]。在正常生理状态下，NFκB与其抑制因子IκB 蛋白家族中成员相结合而滞留于细胞质中，不具有转录活性。当细胞受到剌激，启动细胞第二信使系统IκB磷酸化及泛素化，发生降解并与NFκB解离，NFκB激活，由胞质移位至胞核，与DNA上的启动子区域相应靶基因位点结合，从而启动一系列免疫和炎症反应相关基因的转录程序，诱导众多细胞因子，如TNFα、IL1、IL6、IL8等的高度表达。通过本组实验中对大鼠脑损伤模型NFκB在大鼠脑皮质内水平的观察，发现伤后24小时NFκB即在血管内皮细胞和神经胶质细胞内被激活，并且这种活化能够持续1周。NFκB活化使机体效应细胞大量释放促炎细胞因子是导致组织炎症反应过度和组织损伤的关键环节[4]，而血管内皮细胞和神经胶质细胞在整个信号转导途径中，可能起着重要的作用。

　　TNFα是一种生物学功能广泛的细胞因子,也是中枢神经系统中参与免疫应答和炎症反应的重要的介质[5]。在感染、缺血和损伤等因素诱导下,由神经系统中星形细胞、血管内皮细胞、小胶质细胞以及神经元等释放的TNFα可激活多形核白细胞,通过增加位于血管内皮细胞表面的白细胞内皮细胞黏附分子的表达,来增强白细胞的黏附性，促进白细胞黏附于毛细血管壁,并浸润至脑组织。活化的白细胞还可释放多种炎症介质、氧自由基, 在脑缺血再灌注后的组织损伤中起重要作用。我们的研究表明,脑创伤后24小时 TNFα的表达增高并达到高峰,并且在1周后仍维持较高的水平，提示TNFα在创伤后炎症反应及继发性脑损害中可能起着重要作用。TNFα作用的特异性已被外源性TNFα中和抗体的拮抗作用所证实,因此拮抗TNFα的过高表达是治疗颅脑损伤的途径之一。

　　IL1是一种能激活多种免疫和炎症细胞的前炎性细胞因子,主要由单核巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞分泌。IL1包括IL1α和IL1β,前者为分泌型,后者则多与细胞结合。IL1β是脑组织中的主要形式,颅脑损伤后,IL1β激活血管内皮细胞和白细胞,诱导细胞表面的黏附分子的表达明显上调,白细胞在血管内的滚动减慢、牢固黏附。一方面通过渗透进入血管外的组织中,活化的白细胞释放大量的氧自由基和蛋白水解酶,损伤脑组织;另一方面,白细胞的牢固黏附导致微血管阻塞,脑组织缺血缺氧,从而促进神经细胞的凋亡，加重脑组织的损伤。本组实验中证实IL1β的表达在脑创伤后24小时明显增高并达到高峰,1周内仍维持较高的水平。有实验证实其细胞因子mRNA的表达与炎症程度呈正相关,反映了颅内的神经细胞炎症反应[6],其升高程度可作为临床上判断疾病严重程度和疗效的指标[7]。

　　2 黄体酮对大鼠脑外伤后炎症反应及继发性脑损伤的干预作用

　　作为神经甾体的一员，黄体酮广泛存在于神经系统。黄体酮可以抑制转录因子NFκB的活性，进而导致TNFα、IL1β等炎症因子表达的下降[8]，使脑组织炎症反应得到抑制，对继发性脑损伤(SBI)起到了保护作用。黄体酮可能通过两条途径来抑制，其中主要的一条是黄体酮可以促进内源性NFκB抑制因子IκB的产生;另一条途径是，当黄体酮存在时，黄体酮受体可以和NFκB P65亚单位组成异源二聚体，进而阻断NFκB的转录作用[9]。

　　本组研究显示，当TBI发生后1、3、5、7天，NFκB p65、TNFα、IL1β的表达以及神经细胞的凋亡均明显升高，而黄体酮可以抑制这种升高。脑损伤后，TNFα、IL1β等促炎细胞因子可以促进C3、NFκB和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等的合成。C3和NFκB等反过来刺激TNFα等细胞因子的释放[10,11]。通过对NFκB p65 、TNFα、IL1β表达的下调，黄体酮对TBI后局部炎症反应发挥了抑制效应。创伤性脑损伤后，脑水肿迅速发生，并向原发损伤区域以外扩展。黄体酮可以减轻创伤性脑损伤模型的脑水肿程度和持续时间，减少神经元变性[12,13]，当保持血药浓度相当于正常孕鼠血中的浓度时，黄体酮就可以有效减轻创伤后脑水肿的程度。有学者报道[8]，黄体酮能够抑制自由基诱导的脂质过氧化，保护血脑屏障免受破坏，进而减轻脑水肿。结合我们的实验结果，对促炎性因子的抑制作用可能是黄体酮能够减轻脑水肿抑制细胞凋亡的主要机制之一。此外，作为天然孕激素，黄体酮对生殖系统上的其他脏器也可发挥作用，如通过竞争性地对抗醛固酮，促进钠、氯离子排泄和利尿作用。

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