白藜芦醇对大鼠脑创伤后伤区脑组织神经细胞凋亡的影响

　　作者：周杰，雷鹏，章翔，蒋晓帆，荔志云，武弋，黄艳萍 作者单位：兰州军区兰州总医院神经外科，甘肃 兰州 730050

　　【摘要】 目的 探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对大鼠脑创伤后神经细胞凋亡的影响及可能的作用机制。方法 采用改良的Feeney自由落体脑损伤模型，对颅脑损伤大鼠用Res(50mg/kg，ip)治疗，应用原位末端标记法(TUNEL)及免疫组织化学方法检测受损脑组织治疗前后TUNEL阳性细胞数、Bcl2及Bax的表达变化。结果 治疗组大鼠脑组织TUNEL及Bax表达阳性细胞数低于创伤组及对照组(P<0.05)，Bcl2表达伤后持续升高，治疗组高于对照组和创伤组(P<0.05)，创伤组和对照组差异不明显(P>0.05)。结论 白藜芦醇具有抗凋亡作用，可能是通过抑制促凋亡因素，促进抑凋亡因素表达来减少颅脑损伤后神经细胞的凋亡，发挥脑保护作用，其详细机制有待进一步研究。

　　【关键词】 颅脑损伤;白藜芦醇;末端标记法

　　Effect of resveratrol on the neural apoptosis of impaired brain tissue in rats with head injury

　　ZHOU Jie,LEI Peng，ZHANG Xiang,et al.

　　(Department of Neurosurgery,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,Lanzhou 730050，China)

　　Abstract: Objective To investigate the effects and possible mechanisms of resveratrol on neural apoptosis of impaired brain tissue in rats with head injury.Methods The craniocerebral injury model was created by Feeney’s methods,local brain injury rats were treated with resveratrol(50mg/kg,ip).Immunohistochemisty was used to detect the apoptosis index of TUNEL and expression of Bcl2 and Bax in the impaired brain tissue.Results The apoptosis index of TUNEL and percentage of Bax positive cells in the treatment group were less than that in the control group(P<0.05).There was no significant difference between the control group and the trauma group(P>0.05).The percentage of Bcl2 positive cells in the treatment group was more than that in the control group(P<0.05).There was no significant difference between the control group and the trauma group(P>0.05).Conclusion Resveratrol can reduce the neural apoptosis of impaired brain tissue after brain injury in rats through the inhibition of expression of TUNEL and Bax,on the other hand,resveratrol may promote the expression of Bcl2,the mechanism of which needs further research.

　　Key words:brain injury;resveratrol;TUNEL

　　近期研究表明，细胞凋亡在脑损伤后的神经细胞死亡中可能起重要作用[1]。本实验对局灶性颅脑损伤大鼠给予白藜芦醇(resveratrol,Res)治疗，应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)及免疫组化染色方法，比较治疗组与创伤组、对照组之间损伤脑组织中神经细胞凋亡状态及相关蛋白Bcl2和Bax的表达，探讨白藜芦醇对颅脑损伤后神经细胞凋亡的影响，进一步了解白藜芦醇对颅脑损伤的保护作用，以期获得高效、低毒、价廉的潜在性临床药物。

　　材料与方法

　　1 实验动物与分组

　　健康成年雄性SD大鼠75只，体重(250±30)g，购于第四军医大学医学实验动物中心。随机分为：(1)治疗组：改良Feeney自由落体脑损伤装置致伤动物，给予白藜芦醇(50mg/kg)腹腔注射治疗，于伤前1天治疗1次，伤后每天治疗1次，直至动物处死;(2)对照组：同法致伤动物，给予等量生理盐液腹腔注射治疗;(3)外伤组：同法致伤动物不予治疗，伤后自由喂养。每组根据伤后处死时间点不同，再分为3、12、24、48、72小时组，共5个亚组，各亚组每组动物5只。

　　2 试剂及仪器

　　Res购于西安华萃生物技术公司，使用前以生理盐液稀释至浓度为2%;TUNEL试剂盒，兔抗大鼠Bc12及Bax试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司;DAB购于Sigma公司;山羊抗兔IG及正常山羊血清购于北京中杉金桥生物技术有限公司;SABC试剂盒购自福建迈新生物公司;其他试剂均为分析纯，实验室自备;恒冷冰冻切片机(德国Leica公司)，光学显微镜(BX60，日本Olympus公司)。

　　3 实验方法

　　所有动物用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，剪去大鼠头部毛发固定大鼠，矢状正中切开头皮，暴露顶部，于右侧中线旁2mm、冠状缝后4mm处，牙科钻钻一直径约5mm骨窗，保持硬膜完整，骨蜡止血。直接采用自由落体颅脑损伤模型制作方法(改良Feeney法[2]，击锤重20g，底面直径约4mm,30cm高处自由落体致伤右额顶骨窗部，造成局灶性脑损伤模型)，缝合头皮，消毒后放回笼内饲养，正常喂食水(死亡者剔除)。按实验设计给予Res处理，分别在规定时间点深麻醉(>40mg/kg,i.p)动物后迅速开胸经左心室至升主动脉插管，剪开右心耳，以150ml生理盐水冲洗，随后用4℃含4%多聚甲醛的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)先快后慢灌流固定2小时，取脑置于20%蔗糖中过夜，次日取伤区脑组织经PBS洗涤后用恒冷切片机连续冠状切片，片厚30μm，分组置于PBS中存放，部分伤区脑组织制作石蜡切片。

　　4 TUNEL染色法

　　取一组切片，按博士德公司的TUNEL检测试剂盒操作说明进行：切片用4%多聚甲醛/0.1mol/L PBS(pH 7.0～7.6)室温固定，PBS漂洗;3%H2O2室温处理，蒸馏水洗;标本片加Proteinase K 37℃消化，PBS漂洗;加标记液，置于湿盒中，37℃标记2小时，PBS漂洗;加封闭液：生物素化抗地高辛抗体加至标本片上，置于湿盒中，37℃反应，PBS漂洗;加SABC至切片，37℃反应，PBS漂洗;DAB显色，苏木素轻度复染，PBS漂洗;脱水，透明，封片，显微镜下观察。

　　5 Bcl2和Bax免疫组织化学方法

　　各取一组切片，在相同条件下按博士德公司的兔抗大鼠Bc12及Bax试剂盒及福建迈新生物公司SABC试剂盒操作说明进行。切片在0.01mol/L PBS中漂洗后，入含0.3%Triton X100的0.01mol/L PBS中室温浸泡30分钟，微波抗原修复,然后：(1)分别入兔抗大鼠Bc12及Bax抗体稀释液(1：100)，室温孵育24小时;(2)生物素标记相应种属抗体(1：200)室温放置2小时;(3)生物素卵白素HRP复合物(SABC，1：500) 室温浸泡2小时,然后用葡萄糖氧化酶DAB法呈色，阳性产物为细胞浆中有棕黄色颗粒者，结束染色的切片经漂洗后脱水、透明，中性树脂封片，显微镜下观察。

　　6 结果观察和图像采集

　　光镜下(BX60，Olympus，Japan)观察切片并应用软件(Mivnt图像分析系统，Germany) 在×40目镜下计数阳性细胞率。计数方法：每张切片取10个高倍视野，每个视野计数100个细胞中阳性细胞数，取平均值代表该张切片阳性细胞率，同法记数各时间点切片的阳性细胞数，总平均数代表该时间点的阳性细胞率，均以百分比表示。TUNEL阳性结果用凋亡指数(apoptosis index，AI)表示，Bcl2和Bax免疫反应的结果用平均阳性率(percentage,P)表示。

　　7 统计学处理

　　实验数据用均数±标准差(±s)表示，采用成组t检验，显著性检验水准取双侧a=0.05，以SPSS13.0软件进行统计分析。

　　结果

　　1 TUNEL染色阳性产物为细胞核中有棕黄色颗粒，正常脑组织细胞核无着色(图1)。各组动物TUNEL凋亡指数在伤后3小时开始升高，48小时达到峰值(图2)，随后稍下降;治疗组凋亡指数显著低于创伤组和对照组，创伤组和对照组之间凋亡指数无显著差别。具体数据见表1。

　　2 正常脑组织Bc12染色细胞桨无着色(图3)，Bc12染色阳性产物为细胞浆着色，偶有胞膜染色(图4)，各组动物伤后Bc12阳性细胞在伤后3小时开始升高，48小时达到峰值，随后稍下降;治疗组阳性细胞百分比持续升高，显著高于创伤组和对照组，创伤组和对照组之间无显著差别。具体数据见表2。

　　3 Bax染色阳性产物同样为细胞浆着色(图5)，对照侧未着色(图6)，各组动物伤后Bax阳性细胞在伤后早期即升高，48小时达到峰值，随后稍下降;治疗组平均阳性率显著低于创伤组和对照组，创伤组和对照组之间无显著差别。具体数据见表3。

　　图1 正常大鼠,脑细胞核无着色(TUNEL法，DAB染色 ×400)(略)

　　图2 伤后48小时损伤区着色明显(TUNEL法，DAB染色×200)(略)

　　图3 正常大鼠脑细胞浆Bcl-2染色未着色(SABC法，DAB染色 ×400)(略)

　　图4 创伤后大鼠脑细胞Bcl-2染色胞浆呈黄色(SABC法，DAB染色 ×400)(略)

　　图5 损伤区脑细胞Bax染色呈阳性反应(SABC法，DAB染色 ×400)(略)

　　图6 对照侧脑细胞Bax染色未着色(SABC法，DAB染色 ×400)(略)

　　表1 大鼠脑创伤后TUNEL凋亡指数变化(略)

　　与对照组比较：△P<0.05;与创伤组比较：*P>0.05

　　表2 大鼠脑创伤后Bcl-2阳性细胞率变化(略)

　　与对照组比较：△P<0.05;与创伤组比较：*P>0.05

　　表3 大鼠脑创伤后Bax阳性细胞率变化(略)

　　与对照组比较：△P<0.05;与创伤组比较：*P>0.05

　　讨论

　　研究表明动物或人类脑组织中存在神经细胞凋亡，颅脑外伤后脑组织神经细胞凋亡显著增加[3]。随着分子生物学研究的发展，人们逐渐认识到细胞凋亡可以受体内外各种因素的调节，尤其是受凋亡相关基因的调节[4]。对于细胞凋亡研究主要是了解原始损伤后的自毁过程，分析影响细胞凋亡的因素，探索影响因素的各种方法，改善和预防继发性不良改变。

　　近年来TUNEL技术广泛用于细胞凋亡的研究，TUNEL的基本原理是DNA聚合酶或末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)能在DNA断裂末端加尾掺入标记的核苷酸，能将凋亡细胞同其它损伤造成DNA断裂区分开，能特异区分凋亡与坏死，是一种用于检测细胞凋亡的敏感技术。

　　Bcl2和Bax是近年来研究较多的细胞凋亡调控基因，目前认为Bcl2过量表达能抑制多种因素诱导的细胞凋亡,Bax则通过抑制Bcl2的活性而使凋亡易于发生，具有促进凋亡的作用，Bcl2及Bax的相互作用是凋亡作用的关键。Bc12/Bax可形成同源或异源二聚体，Bax/Bcl2二者相互拮抗，组成一个平衡体系[6]。正常脑组织中Bc12与Bax之间是互为平衡的，颅脑损伤后该平衡可能受到破坏，Bcl2与Bax在颅脑损伤后神经细胞凋亡中扮演着重要角色，共同调节颅脑损伤后神经细胞的凋亡。

　　脑外伤后胞膜对Ca2+的通透性增加，引起胞内Ca2+超载，激活依赖于Ca2+的内源性核酸内切酶，启动凋亡过程，脑内与凋亡有关的基因发生了变化，其中Bcl2家族基因最重要。Bcl2具有改变线粒体通透性能力，并可通过此途径抑制细胞凋亡，但Bc12家族调节凋亡机制目前尚不完全清楚[7]。对神经系统损伤后的细胞凋亡和自身修复的分子病理过程进行深入探讨的目的在于研制出抗神经细胞凋亡的药物，从而促进损伤神经细胞的修复。因此，抗神经细胞凋亡成为颅脑外伤救治的重要方面，由于凋亡与坏死具有不同的生物学特征，凋亡过程更易通过药理学进行干预，这无疑为脑损伤的治疗提供了新的思路。

　　Res是一类存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化合物，已证明Res具有抗血小板聚集、抗炎、清除自由基、抗癌、抗氧化、心血管保护等众多作用[8]。近来，Res对神经系统的保护作用成为研究的热点，深入研究白Res的作用和机制具有重要的临床意义。

　　由于Bax蛋白与Bcl2蛋白的比值决定细胞受刺激后是凋亡还是存活：Bax蛋白占优时细胞凋亡，Bcl2蛋白占优时则细胞存活。Res对Bcl2和Bax的不同作用导致受损脑细胞的转归。本实验结果证实在颅脑伤后Bax蛋白水平升高，即凋亡促进因子上调，而Res抑制凋亡促进因子Bax的表达，增强Bcl2蛋白表达，从而抑制脑创伤后的神经细胞凋亡，减轻神经病理损害，具有神经保护作用。对脊髓损伤治疗作用的实验研究[9]已发现，Res可以通过促进Bcl2表达、抑制Bax表达的方式保护脊髓，这种能够增强抑制凋亡因子Bcl2的表达并减弱促凋亡因子Bax表达的作用将会给临床药物治疗脊髓损伤带来新的希望。还有实验证明Res对脑缺血具有保护作用，可能是通过抑制细胞凋亡和抑制MMP9来实现[10];另外黄艳等[11]研究证实由于Res具有较强的抗氧化活性，对DNA损伤具有保护作用，能对帕金森病患者黑质细胞凋亡起拮抗作用。

　　实验研究还发现，TUNEL、Bc12和Bax均在邻近区表达，而不是在损伤区，考虑可能损伤区神经细胞已死亡，无反应能力。Bcl2蛋白在脑损伤后早期即有表达，24小时开始较高表达，48小时后持续升高，该阳性细胞形态正常且结构完整，这表明Bcl2蛋白在损伤较轻的细胞中较高表达;Bax蛋白在损伤后早期也有表达，48小时表达明显，72小时表达下降，细胞有变形。作者推测Bc12蛋白在损伤早期尚有活力的细胞中高表达，从而抑制细胞凋亡;而Bax蛋白则在注定要死亡的细胞中高表达;Bc12蛋白可以防止或减少损伤导致的神经细胞凋亡，但其作用有限，若不能挽救受损细胞，则会启动Bax基因表达，进而促进细胞凋亡。本实验显示Res可明显上调Bc12蛋白的表达，下调Bax蛋白的表达，这将有助于进一步研究Res在中枢神经损伤方面的作用机制。

　　本实验研究结果显示治疗组大鼠受到自由落体伤后经Res腹腔注射治疗,TUNEL阳性细胞数与对照组相比较，存在显著差异，有统计学意义(P<0.05)。表明Res可以减少颅脑损伤后神经细胞的凋亡，有助于神经细胞的修复和功能的恢复。同时，治疗组大鼠Bcl2阳性细胞数相对于对照组增多，有统计学差异(P<0.05),治疗组Bax表达明显低于对照组(P<0.05)，提示Res在颅脑损伤后对神经细胞的保护作用可能与Bax的表达下调有关。其中有可能通过抑制Bax的表达，使促凋亡作用减弱，重新调整了Bcl2和Bax之间的平衡，减少了神经细胞的凋亡，起到保护脑组织的作用。细胞凋亡的影响因素很多，而作者研究时间较短，观察时间点还不够多，对Res影响神经细胞凋亡的详细机制还需进行更多方面的研究。

　　【参考文献】

　　[1]Lossi L，Merighi A.Invivo cellular and molecular mechanisms of neural apoptosis in the mammalian CNS[J].Pro Neurobiol,2003,69(2):287-312.

　　[2]Feeney DM,Boyeson MG,linn RT,et al.Responses to cortical injury: I.Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res,1981，21(1):67-71.

　　[3]Nathoo N，Narotam PK，Agrawal OK，et al.Influence of apoptosis on neurological outcome following traumatic cerebral contusion[J].J Neurotrauma，2004，101(2)：233-240.

　　[4]Lee BH，Lee KH，Kim UJ，et al.Injury in the spinal cord may produce cell death in the brain[J].Brain Res,2004,1020(1-2):37-44.

　　[5]Clark RS，Kochanek RM，Watkins SC，et al.Caspase3 mediated neuronal death after traumatic brain injury in rats[J].J Neurochem，2000,74(4):740-753.

　　[6]Jang JH,Atuoma OI,Jen LS,et al.Ergothioneine rescues PC12 cells from beta-amyloid-induced apoptotic death[J].Free Radic Biol Med,2004,36(3):288-299.

　　[7]Graham SH,Jun C,Clark RS.Bcl2 family gene products in cerebral ischemia and traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2000,17(10):831-841.

　　[8]Burns J,Yokota T,Ashihara H,et al.Plant foods and herbal sources of resveratrol[J].Food Chem,2002,50(8):3337-3340.

　　[9]刘世清，梅红军，刘军,等.白藜芦醇对大鼠脊髓损伤早期Bc12和Bax表达的影响[J].中国临床康复,2005,9(2):130-132.

　　[10]彭雅滨，章翔，蒋晓帆，等.白藜芦醇对小鼠局灶性脑缺血的保护作用及其机制[J].中国临床康复,2005,9(1):106-107.

　　[11]黄艳,朱汉卿,郑鸿燕,等.白藜芦醇抗帕金森病黑质细胞凋亡的实验性研究[J].江苏药学与临床研究,2005,13(2):7-9.