神经干细胞的研究进展

作者：高乃康,毛伯镛

作者单位：内蒙古医学院第一附属医院神经外科， 内蒙古 呼和浩特 010059

   【摘要】  神经干细胞由于具有自我更新和多方向分化潜能的功能，使神经系统损伤后的细胞替代治疗成为可能，亦是近年来研究热点，但其生物学性状和分化调控机制尚不明了，本文就神经干细胞的特性、表现、分化、迁移、临床应用及存在的问题等进行综述。

【关键词】  神经干细胞 表型 细胞分化 基因

       20世纪90年代，Galli等[1]从成年小鼠纹状体分离出一种能够在体外不断分裂增殖、具有多分化潜能的细胞群，称为神经干细胞 （neural stem cells，NSCs）。这一发现彻底改变了中枢神经系统神经元不能再生的认识，为神经系统的损伤修复研究提供了一种新的治疗策略。本文就近年来对NSCs的研究进展，综述其特点、分布、生物学特性及临床应用前景。

    1    NSCs特性与来源

    NSCs具备以下几个特点：①自我维持和更新的能力。②增殖分裂能力，并足以提供大量脑组织细胞。③自我更新和分化潜能可维持相当长时间，对损伤和疾病具有终生反应能力。④多向分化潜能，可分化为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞。⑤有一定迁移能力，能到达损伤或疾病部位并产生新细胞。NSCs 可通过两种方式生长，一是对称性分裂，形成两个相同的NSCs 或两个祖细胞；二是不对称性分裂，由于细胞质中调节分化蛋白不均匀性分配，使得一个子细胞成为祖细胞，并在外界因子刺激下不可逆地向多个细胞系终末期分化，另一个子细胞则保留NSCs 亲代的特征，分化细胞的数目受分化前NSCs 数目和分裂次数的控制[2，3]。

    在哺乳动物的胚胎大部分脑区，包括皮质、嗅球、纹状体、脑室区、脑室下区、海马、脊髓、中脑和后脑等区域均存在NSCs。胚胎神经发生过程中，NSCs在神经管壁增殖，新生细胞沿放射状纤维迁移至脑特定部位，神经管腔形成成年脑室系统，产生NSCs的部位也主要局限于海马和环绕侧脑室的室管膜下层，同时在成年脑嗅球、纹状体、海马、皮质、视网膜和脊髓也发现了NSCs的存在[3～5]。

    2    NSCs的表型特征及其分化

    NSCs的特殊标记物包括巢蛋白 （Nestin） 和波形蛋白。Nestin编码了一个中等纤维骨架蛋白，属于中间丝蛋白家族，在神经板上皮细胞即开始表达，随着神经上皮细胞的分化与成熟而逐渐消失，是早期原始神经细胞的标记物，检测其表达即可确定NSCs的存在。波形蛋白起始于神经迁移时，分化完成后其表达下降，NSCs处于未分化状态，缺乏分化标记[1，3]。

    NSCs发育、分化在时间和空间上具有连续性，受到细胞本身分子基因表达、细胞与细胞间信号转导以及周围环境细胞等影响。以往认为NSCs仅向神经元或胶质细胞等分化，随后实验发现NSCs分化可因环境而显著不同，局部环境决定了移植后NSCs最终的分化，甚至可向多个不同系统分化，即使成熟神经系统内的NSCs也如此。NSCs移植至骨髓环境中可去分化而成为有造血潜能的前体细胞，并在合适的条件下能向肌细胞分化[1，2]。Kondo等[6]发现少突胶质细胞前体细胞 （Oligodendrocyte precursor cells，OPCs） 经小牛血清、骨形成蛋白等孵育后在含碱性成纤维细胞生长因子 （basic fibroblast factor，bFGF） 条件培养液中培养，部分OPCs回复到多潜能NSCs状态，并能重新向神经元方向分化，这一发现提示外部信号可反转神经胶质细胞分化。

    丝裂原样生长因子信号在NSCs的分化发育中起重要作用，已发现维持NSCs特性的丝裂原信号主要有表皮细胞生长因子 （epidermal growth factor，EGF） 和bFGF。体外培养的NSCs和体内前体细胞均发现了丝裂原信号受体，丝裂原信号能使体外培养的NSCs增殖，并使其具有单克隆能力；而撤去丝裂原信号后NSCs则不能增殖[1，3]。不具备丝裂原作用的细胞因子由于其营养作用可避免细胞死亡而使细胞数量相对增加，但不能单独对NSCs起到诱导分化和增殖作用。体外实验证实睫状神经生长因子 （CNTF）、白血病抑制因子 （LIF） 促进NSCs向星形胶质细胞分化，甲状腺素 （T3） 诱导NSCs向少突胶质细胞分化，脑源性神经生长因子 （BDNF）、bFGF在低浓度时和胰岛素样生长因子 （IGF-I） 协同诱导NSCs向神经元分化，此外具有类似作用的还有神经生长因子 （NGF）、血小板源性生长因子 （PDGF）、转化生长因子 （TGF）、神经营养素 （NT） 等，但是它们的作用机制仍不清楚。此外，协同因子作用日益受到重视，cystatin C产物CCg、β连接素 （β-catenin） 和bFGF联合作用能促进神经发生，activin A联合LIF对星形前体细胞的分化诱导作用更明显[1，2，7～9]。

NSCs分化受基因调控，基因表达又受细胞本身的分子程序调控和周围环境影响。Notch基因是确定神经元数量的重要调控基因，当激活Notch途径时，NSCs进行增殖；当Notch活性被抑制时，NSCs进入分化过程。明确Notch信号途径调节方式，可通过改变Notch信号来调控NSCs向神经功能细胞分化的过程和比例，目前已经从人类克隆了3个同源基因Notch 1～3[10]，但其信号传导尚未完全阐明。此外，Janus激酶信号传导递质和转录激活酶信号传导系统以及POU蛋白家族和转录因子也参与NSCs的调控[11～14]。但目前NSCs定向分化仍缺乏可靠的方案，况且体内有上百种类型神经元，每一种神经元的分化过程均涉及多种影响因素和信号传递，如何诱导NSCs高效分化为产生专门递质的功能神经元或特定类型的神经胶质细胞仍处于探索阶段。

    3    NSCs的迁移

    目前，NSCs在体内的迁移机制比较明确的有胚胎早期辐射状迁移和后期链状迁移。海马和脑室下区 （Subventricular zone，SVZ） 是成体脑组织最大的可分裂干细胞库， 海马新生的神经元不再迁移，而SVZ的NSCs则沿着侧脑室前角固定路径向嗅脑链状迁移，但迁移中前体细胞既不突破周围的星形胶质细胞层，也不向比嗅脑更近的其他脑区如纹状体和前脑迁移，这提出了长距离迁移信号的引导作用[1，5]。细胞的成熟度、细胞间信号通信、细胞间基质状态、NSCs自身和其他细胞所分泌的细胞因子与黏附分子、激素和细胞代谢产物均可能影响NSCs迁移状态。已经发现IGF、神经细胞黏附分子 （NCAM）、一氧化氮 （NO）、血小板源性生长因子 （PDGF）、β-catenin、整合素 （integrins）、糖皮质激素 （GC）、内皮素-3 （ET-3） 等均参与了NSCs的迁移调节。现研究多利用病毒载体将目的基因如绿色荧光蛋白片段 （EGFP） 或β-半乳糖苷酶 （Lac Z） 插入NSCs内，或利用同位素标记的胸腺嘧啶核苷 （thymidine）-溴脱氧尿苷 （BrdU） 作为标记物，将 NSCs移植入中枢神经系统内，示踪新生细胞，追踪 NSCs的发源和迁移[5，8，15，16]。

    4    NSCs的应用

    中枢神经系统疾病中很多情况是因为特定的脑细胞发生损伤或退行性改变，而神经元多为分化终末细胞，其自我修复和替代功能基本消失，尽管成体脑内也有NSCs存在，但由于环境因素，形成新神经元能力较弱，导致脑重要结构、神经递质和细胞因子缺失而发生功能障碍。NSCs的发现及其具有潜在分化能力和较强的增殖、迁移能力，作为细胞移植源，可通过体外补充移植和体内激活NSCs，改变细胞生存环境，定向分化为神经元和胶质细胞，重建神经环路和功能，为神经系统疾病的治疗开辟新途径。

    4.1    细胞移植    脑内神经元或神经组织移植治疗癫疒间和帕金森病的研究已开展多年，合适的供体细胞源可存活并与宿主细胞整合而改善功能，但由于胚胎脑组织来源和数量的限制，使神经组织移植进展缓慢。NSCs分离和培养成功，尤其是采用编码致癌蛋白的外源性遗传信息使NSCs永生化，解决了移植物数量不足的问题，也避免了伦理学方面的问题。NSCs移植后可定向、定位分化为功能细胞，替代、补充缺失细胞的结构和功能，释放神经递质、产生神经营养因子等，促进病损神经组织再生和抑制神经变性。成体脑组织损伤后自身修复能力有限，内源性NSCs生成和分化不足，主要原因为脑内存在抑制因子和缺少分裂、迁移、营养信号支持，外源性NSCs移入可改变这种平衡，促进内源性NSCs生成和分化。NSCs移植疗效取决于与宿主神经系统在结构和功能上的整合性。现临床开展的NSCs移植已经应用于帕金森病、脱髓鞘病变和脑、脊髓损伤的治疗[8，13，14，16，17  4.2    基因治疗    利用病毒载体通过转基因技术，将编码递质、神经因子、某些代谢酶或肿瘤抑制因子的基因片段导入NSCs，体外稳定表达后，利用NSCs作为基因载体植入脑损伤区，NSCs整合至宿主脑组织神经环路中，并在脑内进行迁移，改变移植部位微环境，增加NSCs定向分化能力和促进内源性NSCs活化，同时达到细胞替代和基因治疗的作用。NSCs可以携带多个外源基因，临床已用于遗传性黏多糖累积病Ⅶ型 （MPS）、多发性硬化症 （MS） 和帕金森病 （PD） 的治疗，并取得一定疗效[13，14，17～19]。

    4.3    治疗肿瘤    脑胶质瘤临床治疗困难，手术切除后易复发。由于NSCs具有迁移能力，并对胶质瘤有趋向性迁移现象，利用这种生物特性，对NSCs进行转基因处理，使之分泌白细胞介素-4 （IL-4） 和白细胞介素-12 （IL-12），可激活免疫系统，对肿瘤细胞发动攻击。NSCs还可能分泌一种未知物质能缓解肿瘤细胞分裂，延长实验动物生命[18，20]。

    5    NSCs应用存在问题

    NSCs来源不甚充足，转染基因表达的非选择性和部分NSCs移植后出现致瘤现象均面临困难。成体NSCs的准确定位和体内细胞增殖、迁移、分化的机制有待进一步研究。因此，首先明确NSCs的体外性状如细胞分子、功能及基因和可改造性，体内的存活、整合、分化、致瘤性和解剖及功能水平上的治疗效果。其次对NSCs进行基因改造，使其保持干细胞特征而无致瘤性，稳定并无限繁殖，但目前这方面积累的资料不多。

    6    展望

    NSCs的研究虽起步不久，但已显示出诱人的前景。在胚胎和成年动物的脑特定部位均成功培养和分离了NSCs，利用病毒载体向细胞内转染原癌基因SV40大T抗原和V-myc使部分NSCs获得了持续分裂的能力。DNA微列阵技术和基因组的研究，可能明确成体NSCs的准确位置并进而激活其功能。进一步认识NSCs特征和控制分化基因，可使NSCs产生特定的分化细胞来修复病损神经组织和替代其功能。

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