脑胶质瘤干细胞的研究进展及应用前景

作者：尹昌林综述,杨辉审校

作者单位：（中国人民解放军第三军医大学附属新桥医院神经外科，重庆400037）

    【摘要】  脑胶质瘤干细胞（BGSCs）是脑胶质瘤的“种子”细胞，具有自我更新、增殖和多向分化潜能等干细胞属性。BGSCs很可能为神经干细胞（NSCs）转化形成，或者是初步分化的神经祖细胞重新获得了干细胞特性转化而来。BGSCs的发现和成功分离是近来干细胞和胶质瘤起源研究的重大进展之一，对正确认识和理解脑胶质瘤的发生、发展，指导制定更有针对性的治疗措施等具有十分重要的意义。本文就BGSCs的研究进展及应用前景进行综述。

【关键词】  神经胶质瘤；肿瘤干细胞

     既往认为胶质瘤细胞均具有无限增殖能力，但近年研究显示胶质瘤细胞具有异质性，是由不同属性的肿瘤细胞混合构成，并不是所有细胞均具有无限增殖能力，仅脑胶质瘤干细胞（Braingliomastemcells，BGSCs）具有无限增殖能力。BGSCs的发现和成功分离是近来干细胞和胶质瘤起源研究的重大进展之一，本文就其研究进展及应用前景进行综述。

     1BGSCs存在的证据

     1.1肿瘤干细胞（cancerstemcells，CSCs）存在的证据CSCs的假说最初源于发现并非所有肿瘤细胞均能维持肿瘤生长，仅其中一小部分细胞具有产生集落能力[1，2]，当时认为有两种可能：①所有肿瘤细胞均能无限增殖和形成集落，但这种可能性极小。②大部分肿瘤细胞仅具有限增殖潜能，其中一小部分细胞具有无限增殖和形成肿瘤的能力。但该学说当时并未引起重视。随着干细胞研究的深入，人们发现干细胞分化形成的细胞株呈分层树（thehierarchicaltree）结构，而大多数肿瘤细胞具有异质性，类似干细胞的分层树结构。因此Reya等[2]再次提出CSCs学说，并推测CSCs具有正常干细胞一样的自我更新和增殖、分化能力，其来源可能是具有长期存活能力、通过基因突变和后生性变化积累逐渐向恶性化进展的正常干细胞。通过应用干细胞领域的研究技术，学者们陆续从白血病、骨髓瘤和乳腺癌中分离获得了一类细胞，其仅占肿瘤细胞中的少数，具有无限增殖、自我更新、多向分化等类似正常干细胞的属性，证实多种肿瘤中存在CSCs。结合间充质干细胞与肿瘤细胞在多种不同组织中均存在或可能发生的特点，提出了肿瘤的干细胞起源学说，认为肿瘤起源于正常干细胞遗传突变的积累。

     1.2BGSCs存在的证据在BGSCs研究方面，Singh等[3]首先报道以CD133为标志物，用免疫磁珠法从不同类型的新鲜胶质瘤标本中分离出了一小部分与NSCs相似的肿瘤细胞，在体外培养时表现为：①失去了胶质瘤细胞贴壁生长的特点，而呈与NSCs生长方式类似的悬浮生长球体。②在无血清的培养基中能不断自我更新和增殖，但不分化，维持干细胞固有特征。③在血清培养基中分化为与亲本肿瘤形态和分子表型相似的肿瘤细胞。上述证据表明：这一小部分肿瘤细胞即BGSCs。随后从儿童和成人脑胶质瘤中也陆续分离出了BGSCs[4~7]，Kondo等[8]甚至在C6胶质瘤细胞株中也分离出BGSCs。Galli等[6]建立了胶质母细胞瘤细胞株系，证实其在体外培养情况下能自我更新、增殖及分化形成多种细胞系细胞，将肿瘤球细胞植入裸鼠的脑内能形成与亲本同样的胶质瘤，而从该鼠胶质瘤分离的BGSCs再次移植入第2只裸鼠脑内，能形成与第1代裸鼠及亲本同样的胶质瘤。Kondo等[8]和Singh等[9]分别以C6胶质瘤细胞株及人髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤进行实验得到了类似结果。后者发现甚至仅移植100个CD133+细胞（BGSCs）即能形成肿瘤，而移植0.5×106～1×106个CD133-细胞（普通肿瘤细胞）却不能形成肿瘤，仅在注射部位形成胶质瘢痕；该结果不仅证明了BGSCs的干细胞属性，且证实只有CD133+的胶质瘤细胞属于BGSCs。

 2BGSCs的生物学特性

     2.1BGSCs的生物学特性[6~9]已有的研究显示：在体外培养条件下，BGSCs在无血清的培养基中能自我更新、增殖并形成肿瘤球，表达NSCs的标志物Nestin和CD133，但不表达分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物。对肿瘤球进行细胞组成分析发现除BGSCs外，尚有非BGSCs细胞。说明BGSCs同样具有干细胞的不对称分裂属性，在自我更新过程中同时产生BGSCs和非BGSCs细胞。在含血清的培养基中，上述方法获得的肿瘤球于接种后4h左右即贴壁，并开始有细胞从肿瘤球中迁出，迁出的细胞贴壁生长，胞体和突起扁平；24h后肿瘤球变扁，形状不规则，迁出的细胞增多；4~6d时贴壁细胞明显增加。诱导分化8d后肿瘤球内部细胞仍呈未分化状态，而迁移出的细胞形成单细胞层，形态多样，异质性明显，不具有成熟神经元或胶质细胞的典型形态特征，但细胞形态、种类及比例均与亲本肿瘤类似，并表达分化神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物如微管相关蛋白2（MAP2）、β－tubilin3、脱质纤维酸性蛋白（GFAP）、血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）等。异种系列移植实验表明：BGSCs经多代反复移植均能在裸鼠脑内或皮下增殖分化形成与亲本肿瘤形态和分子表型相同的肿瘤，且能侵犯周围组织并向远处转移。

     2.2BGSCs与NSCs生物学行为的异同BGSCs与NSCs在生物学行为上有许多相似之处，如均具有自我更新、增殖和多向分化潜能，表达干细胞标志物Nestin、CD133以及特有基因如musashi－1、Sox－2、bmi－1和CD133等[4]。因此就单个细胞而言，形态学观察及现有标志物难以区分二者。但二者毕竟是作用迥异的两类细胞，因此在许多生物学行为的表现上均有明显差异：在形态上，无血清培养时BGSCs形成的肿瘤球结构较松散，机械吹打时较易散开，而NSCs形成的神经球结构相对紧密，机械吹打时不易散开[7]；有血清培养时二者均发生分化，但BGSCs产生形态、种类及比例均与亲本肿瘤类似分化状态的肿瘤细胞，而NSCs则产生成熟的神经元和胶质细胞。就自我更新和增殖能力而言，BGSCs很容易并且可以无限扩增，如已建立的胶质瘤细胞系可以无限传代，而NSCs则较难扩增，且一般扩增能力有限；另外，生长微环境对NSCs的生长具有非常重要的作用，而BGSCs生长对外环境的依赖相对要小，具有更强的适应环境、继续生长的潜能。在遗传特征上，NSCs为正常的染色体组型46XX或46XY，而已发现BGSCs有异常的染色体组型如45XY，－10，－16和+18等[3]。在功能方面，BGSCs是胶质瘤的“种子”细胞，在肿瘤的发生、发展过程中起决定性作用，而NSCs是正常神经组织的“种子”细胞，对神经组织的发育完善和损伤修复至关重要。

     3BGSCs的细胞来源

     尚无法知道正常机体中是否独立存在CSCs，探讨CSCs的来源实际上是要弄清CSCs起源于机体中哪种正常细胞。目前大致的推断有：更原始的干细胞转化形成、成体干细胞转化形成或初步分化的祖细胞重新获得了干细胞特性转化而来。BGSCs和NSCs在生物学特性上的相似性，提示BGSCs很可能是NSCs转化形成，或初步分化的神经祖细胞重新获得了干细胞特性转化而来。

     3.1BGSCs源于NSCs转化形成的证据越来越多的证据表明：NSCs或神经前体细胞中某些基因的突变或异常激活可能抑制其正常分化而导致肿瘤形成，如Kenney等[10]使小脑外颗粒层干细胞内的抑癌基因Rb高度磷酸化而失活，可诱导形成髓母细胞瘤；Holland[11]在以Nestin－TVA小鼠模型的研究中，将表皮生长因子、血小板源性生长因子基因或致癌基因Ras、Akt导入前脑Nestin＋细胞中能导致与人类相似的胶质瘤，Rao等[12]在小脑内注射带有Shh（Sonichedgehog，Shh）和c－myc的逆转录病毒则能诱发髓母细胞瘤（这些小鼠的转基因表达局限于NSCs中）；Su等[13]发现在NSCs中表达激活的c－myc和RE－1转录沉默因子（REST）神经限制性沉默因子（NRSF）能阻断其向神经元分化，在小脑引起髓母细胞瘤并维持其干细胞性；Lubensky等[14]以放射诱导方法进行研究，结果显示：NSCs或胶质前体细胞的放射损害将抑制细胞的正常分化并导致肿瘤形成。其次，NSCs作为基因治疗载体时有趋向胶质瘤的特征，说明两者间存在着特殊的渊源关系。Aboody等[15]将NSCs植入荷瘤鼠肿瘤局部、脑内远隔肿瘤部位甚至仅采用尾静脉注射，NSCs均可穿越正常组织进入肿瘤组织内生长，并随肿瘤细胞向其他部位迁移；Heese等[16]在体外实验中也发现类似现象。第三，NSCs与BGSCs在细胞抗原表达、培养条件和信号通路等方面也有许多相同或相似之处[17]，如在抗原表达方面，NSCs表达的众多抗原也为BGSCs所表达，包括巢蛋白（Nestin）、CD133、musashi-1、bmi-1等；在培养条件方面，NSCs与BGSCs在无血清培养时均呈球形悬浮生长，需要相同的生长因子维持；在信号通路方面，NSCs与BGSCs的增殖、分化和凋亡等均通过Notch、Wnt、Shh、Bcl－2和第10染色体同源丢失性磷酸酶－张力蛋白基因（PTEN）等信号分子调控。可见，BGSCs在生物学特性上与NSCs非常相似，BGSCs起源于NSCs转化形成的可能性非常大。NSCs较成熟胶质细胞更容易转化形成BGSCs的可能原因包括：①NSCs是未分化的幼稚细胞，在转化过程中较成熟细胞可以减少一个脱分化的过程，也就是说，相比较于成熟细胞，NSCs只需要更少的突变就可以转化为BGSCs。②NSCs有更长的生命周期，因而更容易累积各种致癌性突变的变异发生转化。

  3.2BGSCs源于初步分化的神经祖细胞的证据如果基因改变能使初步分化的祖细胞重新获得自我更新能力，则其也可能是癌变发生的对象。在小鼠和人，与Shh信号改变有关的髓母细胞瘤的表型和基因表达图谱与恶变的小脑颗粒细胞前体细胞非常相似[17]；在用TVA系统进行的研究中，转导基因进入GFAP+的胶质前体细胞和Nestin+NSCs均能导致胶质瘤[11]；在GFAP启动子控制下表达原癌基因Ras或SV40T抗原在大多数动物中也能导致胶质瘤[18，19]，而以S100-β为启动子表达v-erbB基因的转基因小鼠则可导致少突胶质细胞瘤[20]。这些研究提示：初步分化的祖细胞也可能是基因转化的靶点。由于GFAP和S100-β在NSCs中也可表达，因此有必要寻找更为特异的NSCs和祖细胞的标志物以确定BGSCs的细胞来源。

     总之，关于BGSCs以及其他各种CSCs的细胞来源目前仍不清楚，对这个问题的进一步研究将有助于从更广、更深的层次阐明肿瘤的发生机制。

     4BGSCs学说及意义

     脑胶质瘤起源于BGSCs的学说对正确认识和理解脑胶质瘤的发生、发展及其生物学行为如侵袭性、转移、肿瘤的耐药性等均具有十分重要的理论意义和潜在的应用价值。

     4.1从病因角度在胶质瘤中只有BGSCs具有永久性、失控性的增殖能力；胶质瘤祖细胞虽然也增殖,但数代后分化成熟和走向凋亡；而普通胶质瘤细胞对胶质瘤增殖没有影响。因此，只有作为“种子”细胞的BGSCs在脑胶质瘤的发生、发展中具有决定性作用。

     4.2从脑胶质瘤的侵袭播散角度BGSCs所起的作用也是主要的。一方面，迁移性本身就是干细胞的重要属性之一；另一方面，有研究发现干细胞缺乏人类白细胞（HLA）抗原，异体干细胞移植后可长期存活于受体的多种组织中[21]，CSCs可能也缺乏HLA抗原，在向邻近组织侵袭转移以及通过血液或淋巴液向远处转移的过程中出现“逃逸”现象，可以逃过血液和淋巴系统中免疫细胞的攻击，所以存活的可能性较大。CSCs播散到新的位置后，如局部微环境适合，即增殖分化形成新的肿瘤；如局部微环境不适合，即保持静默状态，不进行增殖分化及形成新的肿瘤。这可以解释虽然有时在远离原发部位检测到肿瘤细胞，但并不在局部发生肿瘤。

     4.3从诊断与预后判断的角度由于肿瘤起源于CSCs，因此争取尽早发现体内的CSCs，甚至在其增殖分化导致出现临床表现前（即亚临床阶段）就发现它，将使肿瘤的诊断大大提前，真正做到早诊断。此外，CSCs自我更新、增殖、分化和迁移能力的大小在临床的体现就是肿瘤的生长及播散转移速度的快慢和侵袭能力的强弱，即肿瘤的CSCs决定了其临床恶性程度的高低。若CSCs的上述特性强，则在临床表现为肿瘤生长迅速，容易侵犯周围组织并播散转移，肿瘤的恶性程度高；反之则表现为肿瘤生长缓慢，不易侵犯周围组织及播散转移，肿瘤的恶性程度低。

     4.4从治疗角度以往认为肿瘤细胞均具无限增殖能力，因此设计的治疗方法包括外科手术、化疗以及放疗等均针对全部肿瘤细胞，衡量疗效的标准之一是肿瘤体积是否缩小或消失。但许多肿瘤，尤其是胶质瘤，经过一段时间治疗后又会复发，很难彻底治愈，不能从根本上延长病人生存期，其主要原因在于目前使用的方法均不能有效、彻底地杀死CSCs，特别是已发生播散的CSCs。从肿瘤的生物学特性来看，肿瘤恶性程度的高低和是否容易播散转移决定于CSCs，而作为一种异常的干细胞，CSCs对化疗和放疗的耐受性远较仅具有限增殖潜力的普通肿瘤细胞强，原因有三：①干细胞是静止的并且绝大多数停留于G0期，而G0期细胞本身对化疗和放疗的敏感性有限。②既往研究表明：源于多种组织的正常干细胞比源于同一种组织的成熟细胞更可能产生对化疗药物的耐受，其主要机制与多种耐药基因的高水平表达有关，CSCs很可能也有类似的机制。③SP细胞能选择性地排出细胞内DNA染料如Hoechst33342以及一些化疗药物如拓扑替康和盐酸米托蒽醌等，从而得以存活下来，这与细胞中ABC转运蛋白超家族成员Bcrpl（鼠）-ABCG2（人）的转运作用有关[22]，而胶质瘤中的SP细胞就是BGSCs。从治疗方法的针对性来看，外科手术只能切除原发及侵犯邻近有限范围内的肿瘤，如CSCs播散转移恰好在手术范围内，肿瘤就可能得到根治，反之则不可能得到根治，肿瘤复发不可避免。而药物化疗及放疗主要针对增殖能力相对有限的普通肿瘤细胞，而不是针对CSCs，特别是停留于G0期的CSCs，加之CSCs对化疗和放疗的耐受性远较普通肿瘤细胞强，所以不能根治肿瘤，复发在所难免。因此，要想治愈肿瘤，治疗措施必须针对CSCs，将其杀死或迫使其处于静默状态，才可能达到预期效果。

 5展望

     BGSCs的发现和分离无疑使我们对胶质瘤的认识又大大地前进了一步，但仍有许多问题亟待进一步研究，主要包括以下几个方面：①寻找新的BGSCs特异性标志物或能特异性发现BGSCs的方法。这不仅对早期诊断肿瘤，判断其是否已播散转移，而且对治疗后动态监测肿瘤是否复发或转移，判断其是否得到根治均至关重要。②BGSCs的起源及其生物学特性，调控自我更新及增殖、分化的信号途径以及微环境等。③胶质瘤治疗的靶点选择问题。治疗措施不仅要针对胶质瘤中占大部分的普通肿瘤细胞，更主要的是针对原位和已发生侵袭播散的BGSCs，并充分考虑处于G0期的BGSCs。相信随着对上述问题的深入研究，对脑胶质瘤发生、发展的认识和理解以及指导寻找新的治疗靶点和新型抗肿瘤药物的开发等将获得极大改观。

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