下颌牵张成骨中应用神经生长因子对神经损伤修复的作用

　　作者：杜兆杰，雷德林，王 磊，曹 健，张雅博，张 圃，马 秦，程晓兵 作者单位：(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科，陕西 西安 710032)

　　【摘要】 目的 研究下颌骨牵张成骨中全身注射神经生长因子(NGF)对损伤的下齿槽神经的修复作用。方法 新西兰白兔48只，全麻下行双侧下颌骨牵张成骨术，术后第4天以 0.5mm/12h的速度牵张，共10天。术后即分别给予肌注NGF 0.6μg/d×20天和相当量生理盐水。采用BL420F生物机能实验系统及检测设备，分别在术前、牵张期结束、固定期1、2、4周时行感觉神经动作电位(SNAP)测试。结果 在牵张完成时、固定期1周，NGF组和对照组的SNAP波幅和潜伏期无统计学差异;在固定期2、4周，NGF组波幅明显高于对照组，而潜伏期明显低于对照组(P<0.05)。结论 全身注射NGF有利于牵张成骨中下齿槽神经功能的恢复。

　　【关键词】 神经生长因子;牵张成骨; 感觉神经动作电位;下齿槽神经

　　Recovery effect of systemic injection of nerve growth factor on inferior alveolar nervein a rabbit model of mandibular distraction osteogenesis

　　DU Zhaojie,LEI Delin, WANG Lei, et al.

　　(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Fourth Military Medical University,Shanxi 710032,China)

　　Abstract： Objective To study the recovery effect of the inferior alveolar nerve following systemic injection of NGF (nerve growth factor) in a rabbit model of mandibular distraction osteogenesis.Methods Totally 48 New Zealand white rabbits underwent bilateral distraction osteogenesis with a rate of 0.5mm/12h for 10 days.Immediately after surgery,0.6μg/d×20d NGF or normal saline were intramuscularly injected respectively.BL420F monitoring system was applied to record the sensory nerve action potentials(SNAP) before surgery,at the end of distraction,or at consolidation time of 1,2,4 weeks respectively.Results At the end of distraction and 1 week following distraction,the amplitude of the evoked potentials and latency showed no statistical difference between the NGF group and control group;at the consolidation time of 2,4 weeks,the amplitude of the evoked potentials and latency was significantly higher and lower respectively in NGF group than that in control group(P<0.05).Conclusion Systematic injection of NGF can help to accelerate the function recovery of inferior alveolar nerve in mandibular distraction osteogenesis.

　　Key words：nerve growth factor;distraction osteogenesis;sensory nerve action potential;inferior alveolar nerve

　　牵张成骨技术(distraction osteogenesis,DO)又称为“自体性骨组织工程”，是20世纪50 年代由前苏联学者Ilizarov[1]发展和完善并用于矫治各类四肢长骨畸形的一种方法，90年代后开始应用于口腔颌面外科域[2]，且发展迅速，已成为这一领域的研究热点之一。下颌骨有特殊的解剖结构：下齿槽神经(inferior alveolar nerve，IAN)位于骨性下颌管中，在牵张器植入、下颌骨牵引延长的过程中受到创伤和牵拉，这在一定程度上造成了IAN的损伤[3-5]。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是1952 年Levi.Montalcini最先在研究鸡胚的神经发育过程中发现的。NGF对神经元的存活、生长发育、分化、再生和功能维持起调控作用。现已证实NGF是参与损伤神经再生和功能修复的重要因素，是兼有神经营养因子与促神经突起生长因子双重作用的蛋白质[6]，全身应用NGF在治疗中枢及外周神经损伤中取得了明显的效果，且已应用于临床[7-9]。很多研究证实，NGF及其受体在牵张成骨的过程中出现高表达，而且与牵张应力有着密切关系。随着牵张应力的消失，NGF及其受体的表达很快降低并恢复到正常水平[10-12]，这提示神经损伤在固定期的自我修复过程中，应用外源性NGF很可能会加快神经修复。本研究组的既往研究发现，DO中牵张区局部应用NGF能明显促进IAN的恢复[13]，但全身注射NGF这种更安全的应用方式，是否能促进下齿槽神经的修复仍未明确。因此在本实验中，我们在牵张器植入后当天给予全身注射NGF，检测兔 IAN的感觉神经动作电位(sensory nerve action potential，SNAP)，监测牵张成骨术前及术后不同时期IAN功能的变化，研究全身注射NGF对下颌骨牵张成骨术中IAN功能的影响。

　　材料与方法

　　1 实验动物及分组

　　成年新西兰白兔52只，由本校实验动物中心提供，雄性，口颌系统无异常，体重 2.8～3.2 kg，实验前分笼适应性饲养1周，普通饮食。将兔随机分为9组，Ⅰ组(空白组，4只)和A组(肌注NGF，牵张结束即刻组)，B组(肌注NGF，固定期1周组)，C组(肌注NGF，固定期2周组)，D组(肌注NGF，固定期4周组)，E组(肌注生理盐水，牵张结束即刻组)，F组(肌注生理盐水，固定期1周组)，G组(肌注生理盐水，固定期2周组)，H组(肌注生理盐水，固定期4周组)，每组6只。除Ⅰ组未进行任何干预外，其他8组均行骨牵张术。

　　2 牵张器

　　所用的内置式双侧下颌钛牵张器由西安中邦钛生物材料公司与本课题组共同研制(图1)。所应用的因子是人胚胎提取的NGF，由第四军医大学生化中心提供。

　　图1 下齿槽神经及牵张器

　　3 手术过程

　　兔术前30分钟肌注青霉素30万U，给予肌注氯胺酮50mg/kg，静脉注入苯巴比妥钠40mg/kg，全麻成功后，颌下三角区备皮。取仰卧位固定四肢并常规消毒铺巾后，向颌下三角区局部注射含有1:200000肾上腺素的1%利多卡因2.5ml。沿颌下三角正中切开皮肤和皮下约3cm，显露双侧下颌下缘，切开骨膜并沿其深面向颊侧翻瓣，暴露并保护好颏神经，行牵张器植入。在截骨过程中，一直高度注意保护好下齿槽神经血管束，而且完全固定牵张器后的骨断端未见明显移位，避免了下牙槽管断端对IAN的刺激。创口反复冲洗后将骨膜复位缝合，分层严密缝合皮下和皮肤。将上前牙磨短至原牙冠的一半长，以减少将来下颌前徙时上切牙对下颌牙龈的刺激，以后每周调磨上前牙1次。

　　4 术后处理

　　兔完全苏醒后送回笼中，严密观察并记录其精神、饮食和体重情况。术后伤口每日清洁消毒并涂红霉素软膏2次。术后4天内肌注青霉素，30万U/12h。术后即分别给予肌注NGF 0.6μg/d×20天和相当量生理盐水。经过4天的延迟期后，各组均按照0.5mm/12h的速度连续牵张，总距离10mm。

　　5 神经电生理检查

　　分别在牵张完成时，固定期1、2、4周行IAN和SNAP检测。兔麻醉后取仰卧位，存在角膜反射，安静不动，室温20～22 ℃,颌下三角区刮毛备皮。沿颌下三角正中切开皮肤和皮下约3cm，显露双侧下颌下缘，向颊侧翻瓣，暴露并保护好颏神经。取出牵张器，在下颌骨颊侧颏孔区至下颌骨下缘沿IAN的走行两侧，涡轮机钻头开辟2条平行沟槽，咬骨钳轻轻去除颊侧骨板，玻璃分针小心游离IAN，期间持续滴石蜡油保持IAN湿润。用一直径约为3cm钢圈与皮肤两侧切缘缝合形成油槽，以容纳石蜡油，使IAN处于石蜡油环境中。颏孔端IAN置双极电极作刺激电极，下颌孔端置另一双极电极作记录电极并固定之。在刺激和记录电极间置一针电极接地(图2)。以细电压单刺激的模式，刺激波形为方波,波宽

　　图2 油槽及电极的放置0.5ms，延时5.00ms，无叠加，起始刺激电压为1V，逐渐增加刺激强度直到引出最大稳定动作电位。刺激伪迹到动作电位第1个波峰为潜伏期，峰基线值为波幅。每只兔的双侧IAN测量结果取平均值后进行记录。

　　结 果

　　在48只接受手术的实验兔中，有3只(B、C、F组各1只)在牵张期发生颌下区脓肿，后消瘦死亡，故被排除后续研究。其余45只均耐受手术并保持健康状态。在整个实验过程中，健康兔的体重损失量都<12%。 实验兔在手术后的前2天内仅对软食感兴趣，精神欠佳。而到第3天，开始习惯牵张器，精神基本恢复到术前状态并开始进食普通干草饲料。牵张结束时，所有兔的下颌均明显前凸。

　　SNAP检测结果显示，正常未进行干预组(Ⅰ组)IAN波幅为0.45mv，延迟期为1.49ms。牵张结束时、固定期1、2、4周时NGF组的波幅均高于对照组;牵张结束时、固定期1、2、4周时NGF组的潜伏期均低于对照组(表1，图3、4)。

　　应用SPSS10.0软件包进行student t检验，分析NGF组与对照组之间波幅和潜伏期的差异。P<0.05为有统计学差异。在牵张结束时、固定期1周两组之间的波幅和潜伏期无统计学差异，而固定期2、4周NGF组的波幅和潜伏期均显著高于对照组(P<0.05)。表明，牵张成骨中下齿槽神经在固定期2、4周的神经功能好于对照组。表1 两组波幅及潜伏期(±s)

　　讨 论

　　牵张成骨技术已经成为一种治疗下颌骨畸形或缺损的重要方法。NGF是20世纪50年初由Levi.Montalcini在小鼠肉瘤 细胞内发现的第1个神经营养因子，通常称为7sNGF。NGF对中枢和外周神经系统的生物效应是维持和促进交感神经及来自神经嵴的感觉神经细胞的存活、分化、成熟以及发挥功能，是参与损伤神经再生和功能修复的重要因素。有研究认为未成熟的感觉神经含有大量的NGF受体，有NGF依赖性，直接影响到它的发育和成熟。无论是局部注射或全身注射外源性的NGF都能起到防止神经切断术后感觉神经细胞的死亡。尽管成熟的感觉神经已经不及未成熟神经依赖于NGF，但仍然具有NGF受体，而且能够作为靶原型逆向营养因子影响上一级神经元，表明NGF在成熟的感觉神经中依然起到很大的作用[14]。

　　很多研究已经证实了局部应用NGF修复外周神经(包括IAN)的良好效果。同时Eppley等[15]在应用NGF修复兔下牙槽神经缺损时还发现再生的神经轴突周围有新生骨质生成。研究表明，NGF可能通过如下3种途径促进成骨：(1)诱导感觉和交感神经纤维长入骨痂，感觉和交感神经纤维在正常骨代谢和骨折愈合中发挥重要的作用，丧失这两种神经纤维支配的骨组织会表现为钙化不良或骨质疏松，而NGF正是促进这两种神经纤维发育和再生的主要因子之一[16];(2)直接促进成骨细胞的分化并抑制其凋亡[15];(3)促进局部组织血管生成[17]。但是局部注射存在以下不足之处：局部注射势必要对牵张区造成二次创伤，可能造成局部的物理损伤、炎症、疼痛甚至引起感染等潜在的并发症;局部注射的生长因子代谢快，能暂时形成有效的浓度，但是持续时间不长，虽然缓释载体的应用一定程度上维持了局部注射生长因子的作用时间，但是也存在材料的降解产物反应等诸多问题。全身注射NGF不仅能够避免上述医源性损伤的出现，而且除了直接作用于牵张区外，还可能通过作用于中枢促进外周神经的恢复，在体内维持有效的作用时间。另外，全身注射NGF还有方法简便、不良反应小的优点，而且从心理上更容易被患者接受，可作为一种辅助治疗手段，有广泛的临床应用前景。近几十年来国内外对全身注射NGF的作用机制和临床应用进行了颇多研究，陈燕涛等[18]在对48例周围神经损伤患者的治疗中发现，全身应用NGF对周围神经损伤的恢复有显著的促进作用，同时患者疼痛和乏力症状的改善要明显优于对照组。韩汝政等[19]用NGF治疗颅神经损伤70例(肌内注射NGF)与对照组(常规支持疗法)相比，痊愈率、有效率均高于对照组，并能显著缩短病程，早期应用更佳。张素爱等[20]全身应用NGF对98例面神经炎的患者进行治疗，结果显示NGF对面神经功能的恢复在早期即具有促进作用，且随疗程延长，疗效进一步增加，NGF配合常规治疗明显缩短面神经炎病程，改善预后，并具有不良反应少等优点。Santos等[21]在全身应用NGF对大鼠烧伤的研究中，证实NGF不仅能防止外周神经元的死亡而且还能降低血管通透性和血液黏稠度。综上所述，全身应用NGF对中枢神经、外周神经、运动神经或是感觉神经损伤的修复都有显著的促进作用，而且能不同程度减轻患者的痛苦。

　　下齿槽神经走行于狭窄的骨性下颌管，下颌骨截骨、牵张器安装、骨断端的移位以及对神经的拉伸都有可能对IAN产生直接的损伤[4]。牵张成骨中，由于截骨术后组织渗出、组织的低氧、牵张过程中对周围软组织的延长势必导致牵张区压力的大大增加，动静脉回流受阻，从而对IAN造成间接的损伤，类似于正中神经的“腕管综合征”[22]。然而下颌骨的牵张是造成IAN损伤的最主要因素，牵张中不仅要延长下颌骨及其周围肌肉等软组织，重要的是在牵张的同时对IAN也进行了延长，虽然IAN有一定的可塑性，但是依然会造成IAN的损伤甚至是不可逆的损伤。Rostcam等[23]认为牵张成骨是造成IAN损伤的机械因素，即使以0.5mm/12h的速度牵张仍然会导致IAN的损伤。为了能促进IAN的修复及下颌骨的成骨并缩短DO周期，NGF作为经典的促神经修复因子，其固有的修复IAN和促进成骨作用愈加受到重视。

　　牵张过程中对IAN的延长导致的髓鞘崩解和巨噬细胞的入侵，牵张区的各种内源性因子表达明显增高，随着牵张结束这些因子逐渐恢复到正常水平[11]。因此，外源性因子的最佳干预时机应该选在牵张成骨的固定期。但是同时参考临床上治疗外周神经损伤的时机、方法、剂量及疗程[18-20]，为了充分的发挥NGF的作用，我们在牵张器植入术后立即给予肌注NGF，每日1次，直到固定期1周结束。

　　近两个世纪，神经电生理的方法检测下牙槽神经的功能，在临床和实验中已经得到了广泛的应用，神经电生理的方法无论在敏感性还是特异性上有着独到的优势[4，24]。近年来大量文献证实，用诱发神经动作电位的方法能很好的检测在牵张成骨中各个时期神经的受损情况[4]。本实验采用BL420F生物功能实验系统及检测设备诱发并记录IAN的SNAP，波形稳定，重复性好，结果可靠。在SNAP检测中，波幅降低说明有一定数量的神经纤维断裂、轴突缺失;潜伏期延长则说明有节段性轴突脱髓鞘变，神经纤维传导速度降低，由此可反映神经的功能。实验中我们采取完全解剖游离IAN的方法，排除了周围组织对检测结果的影响，能充分反映IAN的功能。我们发现，在牵张结束时、固定期1周，虽然全身注射NGF组IAN的SNAP波幅高于对照组，延迟期低于对照组，但没有统计学差异。而固定期2、4周全身注射NGF组IAN的SNAP波幅明显高于对照组，延迟期明显低于对照组(P<0.05)，在统计学上有显著差异，与王晓霞等[3]、Makarov等[4，5]的研究相符。数据表明，在牵张结束时及固定期1周，可能由于牵张应力等因素诱发的内源性NGF及其受体明显表达增高，虽然牵张完成应力消失，但是牵张区的内源性因子还会保持一定的水平，因此此期间外源性NGF对IAN损伤的修复作用并不明显。而到固定期2周后随着刺激因素消失和代谢作用，内源性的NGF表达显著降低，全身注射NGF能维持外源性NGF在体内的浓度，持续发挥修复IAN损伤的作用。

　　总之，全身注射神经生长因子有利于牵张成骨中下齿槽神经功能的恢复，这有望为临床上减少DO治疗的神经并发症提供一种有效的方法。

　　【参考文献】

　　[1]Ilizarov GA.The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues：PartⅡ.The influence of the rate and frequency of distraction[J].Clin Orthop Relat Res，1989，(239):263-285.

　　[2]McCarthy JG，Schreiber J，Karp N，et al.Lengthening the human mandible by gradual distraction[J].Plast Reconstr Surg，1992，89(1):1-10.

　　[3]王晓霞，王兴，李自力，等.下颌骨牵引成骨术对下牙槽神经功能影响的实验研究[J].中华口腔医学杂志，2002，37(1):50-53.

　　[4]Makarov MR,Harper RP,Cope JB,et al.Evaluation of inferior alveolar nerve function during distraction osteogenesis in the dog[J].J Oral Maxillofac Surg,1998,56(12)：1417-1423.

　　[5]Marina R，Makarov MR,Samchukov ML,et al.The effect of gradual traction on peripheral nerve[M].Craniofacial Distraction Osteogenesis,2001.89-101.

　　[6]Snider WD,Johnson EM.Neurotrophic molecules[J].Ann Neurol,1989,26(4):489-506.

　　[7]Barinaga M.Neurotrophic factors enter the clinic[J].Science,1994,264(5160):772-774.

　　[8]Hayashida K,Clayton BA,Johnson JE,et al.Brain derived nerve growth factor induces spinal noradrenergic fiber sprouting and enhances clonidine analgesia following nerve injury in rats[J].Pain,2008,136(3):348-355.

　　[9]Shao Y,Ma H,Wu Y,et al.Effect of nerve growth factor on changes of myelin basic protein and functional repair of peripheral nerve following sciatic nerve injury in rats[J].Chinese Journal of Traumatology(English Edition),2002，5(4)：237-240.

　　[10]Byun JH,Lee JH,Choi YJ,et al.Coexpression of nerve growth factor and p75NGFR in the inferior alveolar nerve after mandibular distraction osteogenesis[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2008,37(5):467-472.

　　[11]Aiga A,Asaumi K,Lee YJ,et al.Expression of neurotrophins and their receptors tropomyosinrelated kinases(Trk) under tensionstress during distraction osteogenesis[J].Acta Med Okayama,2006,60(5):267-277.

　　[12]Park BW,Kim JR,Lee JH,et al.Expression of nerve growth factor and vascular endothelial growth factor in the inferior alveolar nerve after distraction osteogenesis Int[J].J Oral Maxillofac Surg,2006,35(7):624-630.

　　[13]Wang L,Zhao Y,Cheng X,et al.Effects of locally applied nerve growth factor to the inferior alveolar nerve histology in a rabbit model of mandibular distraction osteogenesis[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2009,38(1):64-69.

　　[14]Barry L,Eppley MD,Robert V,et al.Efficacy of nerve growth factor in regeneration of the mandibular nerve: a preliminary report[J].J Oral Maxillofac Surg,1991, 49(1):61-68.

　　[15]Eppley BL,Snyders RV,Winkelmann TM,et al.Efficacy of nerve growth factor in regeneration of the mandibular nerve: a preliminary report[J].J Oral Maxillofac Surg,1991,49(1):61-68.

　　[16]Wang L,Sun MY,Jiang YG,et al.Nerve growth factor and tyrosine kinase A in human salivary adenoid cystic carcinoma: expression patterns and effects on in vitro invasive behavior[J].J Oral Maxillofac Surg,2006,64(4):636-641.

　　[17]Grills BL,Schuijers JA,Ward AR,et al.Topical application of nerve growth factor improves fracture healing in rats[J].J Orthop Res,1997,15(2):235-242.

　　[18]陈燕涛，何清，刘尚礼,等.神经生长因子治疗周围神经损伤的前瞻性研究[J].中华创伤骨科杂志,2006，8(8):744-746.

　　[19]韩汝政，李化伟，耿正顺,等.神经生长因子治疗颅神经损伤的临床研究[J].中华实用中西医杂志,2005，18(10)：1457-1458.

　　[20]张素爱，陆素琴，储旭华,等.神经生长因子治疗面神经炎45例的疗效观察[J].临床神经病学杂志,2006,19(5):392.

　　[21]Santos FX,Escudero M,Perez L,et al.Comparison of the effects of nerve growth factor and superoxide dismutase on vascular extravasation in experimental burns[J].Burns,1995,21(6):445-448.

　　[22]Yoshii Y,Zhao C,James D,et al.The effects of hypertonic dextrose injection on connective tissue and nerve conduction through the rabbit carpal tunnel[J].Arch Phys Med Rehabil,2009,90(2):333-339.

　　[23]Rostcam D,Farhadieh.The role of nerve growth factor and brainderived neurotrophic factor in inferior alveolar nerve regeneration in distraction osteogenesis[J].J Craniofacial Surg,2003,14(6):859-865.

　　[24]Colin WB.Conduction velocity of the human inferior alveolar nerve[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1997,123(2):185-189.