人脑胶质瘤中Skp2的表达与肿瘤恶性程度及预后关系的研究

作者：牛朝诗,程俊,潘琪

作者单位：（安徽医科大学附属省立医院神经外科安徽省立体定向神经外科研究所，安徽合肥230001）

   【摘要】  目的探讨人脑胶质瘤中Skp2蛋白的表达与肿瘤恶性程度及预后的关系。方法收集胶质瘤石蜡标本52例，其中低恶性度胶质瘤25例，高恶性度胶质瘤27例，采用免疫组化法检测瘤组织内Skp2、Ki-67的表达情况。同时，对病人的生存时间进行随访。结果①Skp2在低、高恶性度肿瘤表达的阳性率分别为56%和81.5%。两组间差异显著(P＜0.01)。②Skp2和Ki-67在胶质瘤中的表达呈显著正相关（r=0.818，P＜0.01），在Skp2表达阳性的胶质瘤细胞中其Ki-67的标记指数明显高于相应Skp2表达阴性者（P＜0.05）。③Kaplan-Meier生存分析显示，Skp2高表达组（Skp2LI＞15%）累积生存率显著降低（P＜0.05)。结论Skp2蛋白的过表达可能参与了胶质瘤的恶性进程。检测胶质瘤的Skp2蛋白水平可能有助于评价肿瘤的生物学行为和预后。

【关键词】  神经胶质瘤；Ki-67抗原；S期激酶相关蛋白质类；免疫组织化学

     Skp2proteinexpressioningliomasanditscorrelationwithmalignancy

     ofgliomasandprognosisinthepatients

     NIUChaoshi,CHENGJun,PANQi

     DepartmentofNeurosurgery,InstituteofStereotaxisNeurosurgery,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,

     Hefei230001,China

     Abstract:ObjectiveToinvestigateSkp2proteinexpressioningliomasanditscorrelationwithmalignancyofgliomasandprognosisinthepatients.MethodsParaffin-embeddedsamplesofgliomaswerecollectedfrom52patients,including25gradeⅠ-Ⅱand27gradeⅢ-Ⅳgliomas.TheexpressionlevelsofSkp2proteinandKi-67nuclearantigenweredeterminedbyimmunohistochemicalmethods.Meanwhile,thepatientswerefollowedupduringtheiroverallsurvivalperiod.ResultsThepositivepercentagesofSkp2expressioningradeⅠ-ⅡandgradeⅢ-Ⅳwere56%and81.5%,respectively.Thestatisticaldifferencebetweentwogroupswassignificant(P＜0.01).TherewasapositivecorrelationbetweenSkp2andKi-67expressions(r=0.818,P＜0.01).TheKi-67labelingindexofgliomacellswithpositiveSkp2expressionwashigherthanthatwithnegativeSkp2expression(P＜0.05).AccordingtotheKaplan-Meiercurves,thehighSkp2expressiongroup(Skp2LI＞15%)showedsignificantlyshorteroverallsurvivaltimethanthatoflowSkp2expressiongroup(P＜0.05).ConclusionOverexpressionofSkp2mayplayaroleinthemalignancyofgliomas.DetectingtheexpressionlevelofSkp2proteinwillbehelpfultoevaluatethebiologicalbehaviorsofgliomasandprognosisinthepatients.

     Keywords:glioma;Ki-67antigen;S-phasekinase-associatedproteins;immunohistochemistryS期激酶相关蛋白2（S-phasekinaseassociatedprotein2，Skp2）是泛素连接酶复合物的底物识别序列，对正常细胞周期调控起重要作用。近年来，一些研究表明Skp2具有原癌基因的潜能，在人类多种恶性肿瘤中过表达，与肿瘤的发生、发展及预后关系密切[1~3]。本研究选取2001年1月～2005年1月于我院行手术切除、随访资料齐备且保存完好的人脑胶质瘤石蜡包埋标本52例，应用免疫组化技术分析Skp2在人脑胶质瘤中的表达及与胶质瘤恶性程度标志物——Ki-67标记指数的相关性，同时结合临床随访，探讨Skp2的表达与胶质瘤的恶性程度及预后的关系。

 1材料与方法

     1.1组织标本男29例，女23例；年龄2～74岁，平均45.7岁。按照WHO（2000年）中枢神经系统肿瘤分类，低恶性度组（WHOⅠ～Ⅱ级）25例，其中毛细胞型星形细胞瘤11例，弥漫性星形细胞瘤11例，少枝胶质细胞瘤3例；高恶性度组（WHOⅢ～Ⅳ级）27例，其中间变性星形细胞瘤13例，多形性胶质母细胞瘤12例，胶质肉瘤2例。

     1.2免疫组织化学染色采用免疫组化S-P法，操作按说明书进行。每例石蜡标本以4μm厚连续切片，常规脱蜡和水化。石蜡切片的抗原修复，Skp2和Ki-67分别采用pH9.0和pH6.0的1mmol/L的EDTA修复液，高压锅加帽出气后3min，快速冷却；3%的H2O2处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，鼠抗人Skp2单克隆抗体（1∶50稀释，Zymed，ZM-0454，克隆系：1G12E9）、Ki-67（1∶50稀释，Zymed，ZM-0166，克隆系：K-2）4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理15min，辣根酶标记链霉卵白素处理15min，DAB显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作空白对照，用已知阳性的乳腺癌切片作阳性对照。

     1.3结果判定Skp2、Ki-67以细胞核被染为棕黄或棕褐色为阳性细胞。每张切片选取具有代表性的肿瘤区域在高倍镜（400×）下随机选择10个视野，计数至少500个肿瘤细胞，计算阳性细胞所占的百分率作为Skp2、Ki-67的标记指数（labelingindex，LI），并据此对染色结果进行分级，以LI＜5%为阴性（-），5%～25%为阳性（+），＞25%为强阳性（++）。

     1.4统计学分析生存时间从术后病理诊断确立至病人死亡或末次随访时间。采用SPSS10.0软件进行统计学分析。使用Spearman等级相关分析Skp2和Ki-67之间的相关性。Skp2蛋白和Ki-67蛋白表达的关系用两组独立样本t检验。生存率的比较用Log-Rank检验。以P＜0.05为统计学有显著性差异。

     2结果

     2.1胶质瘤中Skp2蛋白的表达Skp2的阳性反应产物主要定位在细胞核（图1A、1B），少数标本（5%）除细胞核阳性外还伴有胞质的少量表达。

     2.2胶质瘤中Skp2蛋白的表达与肿瘤恶性程度的关系25例低恶性度胶质瘤中有14例Skp2蛋白表达阳性，阳性率为56%；27例高恶性度胶质瘤中有22例Skp2蛋白表达阳性，阳性率为81.5%（表1）。

     胶质瘤组织中Ki-67蛋白的阳性染色主要表现为细胞核染成棕黄色（图2A、2B）。Ki-67的LI随着肿瘤恶性程度的增高而增高；且在Skp2表达阳性的胶质瘤中，其Ki-67的LI明显高于Skp2表达阴性者（P＜0.05）（表2）。可见，Skp2蛋白的表达随肿瘤恶性程度的增高而增高，并可能参与了胶质瘤的恶性进程。

     2.3胶质瘤中Skp2蛋白表达与预后的关系失访7例，随访45例，时间13～47个月，末次随访时间为2006年3月。其中16人健在，29人死亡，生存率为35.6%。Skp2蛋白LI的中位数为0.15，将Skp2表达低于0.15为低表达组，高于0.15为高表达组。输入两组病例的生存时间，绘制Kaplan-Meier生存曲线，比较两组生存率的差异。Log-Rank检验显示Skp2高表达组（LI＞0.15）与低表达组（LI≤0.15）病人的术后累积生存率有显著性差异（P＜0.05）（图3）。

     3讨论

     细胞周期是细胞生命活动的基本过程，在细胞周期活动中存在2个重要的“关卡”：G1-S和G2-M转换。越来越多的研究表明，肿瘤发生的根本原因是这2个“关卡”的失控，使得原本应该停止增殖或生理性凋亡的细胞不停地进入细胞周期，因而导致细胞的恶性增殖。其中G1期转换点尤为重要又称“START”，其正负向调节物的功能及表达水平的异常与肿瘤细胞的异常增殖和生物学特性密切相关，而这些调节物的合成和降解也是受到精密调节的。

泛素-蛋白酶体途径是许多细胞周期调节物降解的重要途径，该途径需要泛素连接酶E3的参与。E3是一种多蛋白复合物，由Skp1、Cullin1、Roc1/Rbx1和一种F-box蛋白组成。F-box蛋白是该复合物的底物识别亚单位，而Skp2正是F-box蛋白家族成员之一。目前，已经有许多细胞周期调控蛋白被证明通过Skp2依赖性泛素-蛋白酶体途径降解，包括cyclinD1、cyclinE、CDK抑制因子P27kip1、P21cip1和P130以及转录因子E2F、P53等[4]。其中最受关注的是P27kip1，作为一种在细胞周期G1-S转换中发挥“关卡”作用的抑制蛋白，其功能缺失加速细胞周期的进程，预示细胞可能恶性转化。而且研究还发现Skp2与多个抑癌基因和癌基因有密切关系。肿瘤抑制基因PTEN可以下调Skp2的表达，从而抑制G1-S细胞周期的转换[5]。Skp2可以促进癌基因c-Myc诱导的S期转换，激活c-Myc靶基因，并与c-Myc共同参与肿瘤的形成与增殖[6]。Skp2与H-RasG12v可协同恶性转化动物的原始成纤维细胞[7]，Skp2与N-ras在T细胞淋巴瘤的形成中有协同作用[8]。因此，Skp2基因被认为是一种原癌基因，Skp2蛋白能促进细胞通过G1-S转换“关卡”，从而促进细胞周期的进展、DNA的复制以及细胞的增殖；而且Skp2表达水平的改变可能是多种癌基因、抑癌基因的致癌途径之一。

     在人类肿瘤的研究中发现，Skp2在多种肿瘤中呈高表达，如结直肠癌、宫颈癌、口腔鳞状细胞癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤等[7]，并发现Skp2表达水平高低与肿瘤的恶性程度及预后有关。Yang等[9]用免疫组化法检测622例前列腺癌，74例前列腺癌前病变及4例正常组织中的Skp2表达情况，结果发现在正常前列腺组织中Skp2水平极低，而在前列腺癌及癌前病变中其水平大大增加，与正常组织有显著性差异，且Skp2的表达与临床分期、转移正相关。利用Kaplan-Meier生存分析表明，Skp2高表达的肿瘤病人存活时间较低表达者明显缩短。Dong等[10]对102例喉鳞状细胞癌标本进行免疫组化分析发现Skp2表达阳性率为36.7%，并与淋巴结的转移正相关（P=0.002），说明Skp2与肿瘤发展有关。多因素分析表明：Skp2可作为判断肿瘤预后的一个独立指标。Kudo等[11]用免疫组化法检测了15例口腔上皮非典型增生和37例口腔上皮鳞状细胞癌标本的Skp2表达情况，发现Skp2阳性细胞＞30%的病人平均生存期为11个月，远低于Skp2阳性细胞＜30%者的77个月。Kaplan-Meier生存分析显示，Skp2高表达组（Skp2阳性细胞＞30%）累积生存率显著降低（P＜0.01）。

     我们应用了免疫组织化学方法分析了Skp2在52例人脑胶质瘤中的表达，结果发现Skp2的阳性率在低恶性度组（WHOⅠ～Ⅱ）中仅为56%，而在高恶性度组（WHOⅢ～Ⅳ）为81.5%，两组间有显著性差异（P＜0.01）。同时我们还比较Skp2的表达与核增殖抗原Ki-67表达的关系，发现两者在胶质瘤中的表达高度相关（r=0.818，P＜0.01），且在Skp2表达阳性的胶质瘤中，其Ki-67的LI明显高于Skp2表达阴性者（P＜0.05）。以上结果表明，Skp2蛋白的表达随着胶质瘤恶性程度的增高而增高，Skp2蛋白的过表达可能参与了胶质瘤的恶性进程。同时，通过对随访45例胶质瘤病人的Kaplan-Meier生存分析显示，Skp2高表达组（Skp2LI＞15%）累积生存率显著降低（P＜0.05）。

     总之，基于原癌基因Skp2表达增加引起的细胞周期G1-S调节紊乱可能在胶质瘤的发生、发展中发挥了重要作用。检测胶质瘤病人的Skp2蛋白水平并结合其他临床病理特征可能更有助于评价肿瘤的生物学行为和预后。围绕Skp2为靶点的药物或基因治疗可能是未来的胶质瘤治疗策略之一。

【参考文献】  [1]MasudaTA,InoueH,SonodaH,etal.ClinicalandbiologicalsignificanceofS-phasekinase-associatedprotein2(Skp2)geneexpressioningastriccarcinoma:modulationofmalignantphenotypebySkp2overexpression,possiblyviap27proteolysis[J].CancerRes,2002;62(13):3819-3825.

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[11]KudoY,KitajimaS,SatoS,etal.HighexpressionofS-phasekinase-interactingprotein2,humanF-boxprotein,correlateswithpoorprognosisinoralsquamouscellcarcinomas[J].CancerRes,2001;61(19):7044-7047