神经干细胞和脑肿瘤干细胞相关性研究

作者：黄强

作者单位：（苏州大学附属第二医院神经外科暨脑肿瘤研究室，江苏苏州215004）

   【摘要】  1992年Reynolds从小鼠纹状体分离到神经干细胞（NSC），2003年Sing从脑肿瘤组织中分离到脑肿瘤干细胞（BTSC），这是神经科学领域发生的具有里程碑意义的两次突破性进展，其中NSC和BTSC之间的关系是当今神经肿瘤学界的热门话题。本文结合笔者近年的研究，介绍两者的相似性和不同点、BTSC是否起源于NSC，旨在为脑肿瘤起源细胞和分子病因研究提供新思路，为分子外科治疗寻找新靶点。

【关键词】  肿瘤干细胞；神经干细胞；脑肿瘤起源细胞；细胞分化；细胞遗传学

     自从1992年Reynolds从成年小鼠纹状体中分离到能够不断增殖、具有多向分化潜能的细胞，并提出了神经干细胞（Neuralstemcell，NSC）的概念以来，NSC的研究已成为神经科学的一个重要领域。从NSC的分离、体外培养、分化调控到移植治疗神经系统疾病，各方面均有很大进展。从NSC存在在哺乳动物的鼠、猴到人类胚胎均得到证实后，目前研究热点已从成体NSC分离扩展到从骨髓间充质中分离和定向分化NSC。在NSC的研究取得了一定成果的基础上，一些神经肿瘤学者提出了脑肿瘤干细胞（Braintumorstemcell，BTSC）的概念，BTSC不只是在分离、扩增、分化和鉴定指标等方面与NSC类同，且两者在发生学上可能存在渊源关系。研究认为BTSC是脑肿瘤的起源细胞，而NSC是BTSC的起源细胞；前者已得到了一些实验证据，而后者仍处在推测阶段。目前关于BTSC的报道非常少，但前景看好，随着研究的深入，必将对胶质瘤的发生、发展和治疗等方面有着十分重要的意义。本文结合自身工作，简要回顾NSC的研究进展，着重介绍BTSC的最新研究情况及两者间的潜在联系，旨在拓展胶质瘤起源细胞和分子病因的研究思路，为进一步的分子外科学诊治获取新靶点提供策略。

     1神经干细胞

     Mckay[1]在1997年提出NSC具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，能自我更新并足以提供大量脑细胞的概念，这很快得到公认。NSC具有两种分裂方式：对称和不对称。对称分裂可产生两个干细胞；不对称分裂产生一个祖细胞和一个干细胞，其中祖细胞进一步分化成神经元及胶质细胞，而干细胞则继续分裂为干细胞。高增殖潜能是NSC的基本属性[1，2]。NSC组织分布随种族和年龄有所不同：在胚胎鼠位于纹状体、小脑、中脑、海马、皮质、室管区；成年鼠位于纹状体、海马、皮质、室管膜下层；胚胎期人脑NSC位于皮质、纹状体，成年人脑与室管膜相关，主要位于侧脑室壁和海马的齿状回；另外，在非神经发生区域，如脊髓中也发现了成体NSC[3~5]。迄今为止，尚未发现用于鉴定NSC的特异性标记物，最早是使用巢蛋白（Nestin）、波形蛋白、Musashi蛋白等鉴定NSC的存在[6]。其实这几种标记物均对NSC具有高选择性，而非高特异性。Uchida等[7]发现经流式细胞术所筛选出的CD133+、CD34-、CD45-细胞为NSC。现阶段最常用来鉴定NSC的为CD133，用流式细胞术和免疫磁珠分选均可得到足够数量的表达CD133的NSC。从获得的纯度来看，根据我们的资料以流式细胞术为优。至于Nestin，实际是祖细胞-前体细胞标志物，因为CD133表达起始于神经胚胎形成时，并随着NSC分化为神经元和胶质细胞而停止表达[8]，而Nestin是在神经干细胞分化早期，在神经元标志物和胶质细胞标志物共表达阶段的细胞中表达，即祖-前体细胞中高表达。这些特征在肿瘤干细胞中也存在。

     NSC在体外培养成功后，最大的挑战在于探索如何调控NSC的定向分化。目前认为NSC的分化存在两种调控机制：一是基因调控，已知有大量基因能影响神经元的分化和迁移，例如Notch基因对少突胶质祖细胞维持未分化状态起关键作用；二是外来信号（微环境）的调控，在移植实验中发现，同一来源的干细胞在不同的部位会分化成与该部位的正常细胞性质相同的细胞。现已确认数种营养因子对NSC的增殖分化具有重要作用，如表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）均可维持干细胞自我更新能力和刺激增殖，但两者对细胞最终结局的影响不同，对EGF敏感的NSC形成神经元的非常少（少于1%），而bFGF可以增加神经元的数量[9]。我们的体外研究还表明[10]：不同胎龄的鼠中脑腹侧组织分化成多巴胺能神经元的比例不同，在L-抗坏酸-2-磷酸脂（AA-2P）的诱导下可定向分化成多巴胺能神经元（图1）。另外，在不同因素影响下，NSC还具有横向分化的功能，比如人胚胎NSC与成肌细胞共同培养，结果NSC分化为骨胳肌细胞，说明环境的指导性信号对NSC分化起重要作用，同时也证实了NSC有更大的分化潜能。那么NSC与BTSC共同培养，将会产生什么样的结果，尚未见报告，这是一个非常令人关注的问题。

2脑肿瘤干细胞

     上个世纪20年代，Bailey推测胶质瘤起源于同名的正常细胞，然而上述NSC在体内外的实验中均发现具有潜在的致瘤性；因此，研究者便向胶质瘤起源于正常胶质细胞学说发出挑战。我们在神经节细胞胶质瘤恶变为多形性胶质母细胞瘤的基因芯片研究中，发现了CDC2等3条基因参与NSC分化调控[11]，据此对神经节细胞胶质瘤发生的分子病因进行推测，认为在瘤组织中可同时见到瘤性神经元和瘤性星形细胞两种细胞成分，一是在肿瘤发生发展过程中，两种正常细胞同时发生了相同的分子事件，并且均演变成了肿瘤细胞；二是其前体细胞，也就是上述的NSC或祖细胞发生了肿瘤性分子事件，致使其分化的细胞成为具有不断分裂能力的瘤性细胞。第一种推测虽然较早被人接受，但其发生未免太理想化。Mueller等[12]在胶质肉瘤表型特征的不同区域内，采用显微切割分离技术分离出胶质瘤细胞和肉瘤细胞，并经遗传学分析发现有相同的基因突变，这表明胶质瘤细胞和肉瘤细胞可能来自同一种多能干细胞，或处在分化早期并仍保持着可分化为平滑肌细胞能力的前体细胞。Tsai等[13]在体外实验中也观察到神经干细胞在一定的培养条件下可分化为星形细胞和平滑肌细胞。Mueller和Tsai的研究结果，显然更支持第二种猜测。假如这种猜测成立，那么致瘤性分子事件的阐明显得特别重要，而传统意义上的癌基因和抑癌基因调控失衡的观点，其变异靶部位究竟在哪里成为大家关注的焦点。我们已用cDNAarray技术分析了神经节胶质细胞瘤去分化、恶性胶质瘤体外细胞系SHG-44诱导分化基因差异表达谱[11，14]，得到19条靶基因，正在用组织芯片技术作进一步筛选。对找到的目标基因进一步阐明致癌性分子事件的发生是今后的主攻方向。有人猜测基因变异的影响是作用于肿瘤组织内的某种特殊细胞，但无实验依据。为了证实猜测，学者们做了大量实验，首先提出了肿瘤生成细胞的概念，认为肿瘤是由某种特殊细胞生成的，将其与机体的干细胞作类比，从而提出了肿瘤干细胞的概念[15]，并认为肿瘤中只有一小部分肿瘤干细胞具有广泛增殖形成新肿瘤的能力，而大部分细胞发生分化和凋亡。这一理论，最早在白血病的研究中得到了证实[16，17]；有足够证据表明，在白血病细胞群中，少量的白血病干细胞具有强大的增殖和自我更新能力，而其他大部分白血病细胞不具有这种能力。Singh等[18]由此得到启发，提出了BTSC的概念，认为脑肿瘤来源于BTSC，已从人脑瘤中成功分离并经鉴定后得到确认，我们也用CD133免疫磁珠分选方法，在人脑胶质瘤体外细胞系SHG44[19]和临床标本组织中成功地分离到了CD133+细胞[20]，经体外培养，扩增后又根据其能分化成表达神经元——特异性烯醇化酶（NSE）和星形细胞标志物——胶质纤维酸性蛋白（GFAP）等与亲本体相同的细胞组分而鉴定为胶质瘤干细胞。目前，研究者均用分离正常NSC的技术来分离胶质瘤手术标本中的CD133+细胞，使用有利于NSC生长的培养条件进行体外培养，通过检测NSC的表面标记物CD133来确认BTSC。结果发现，在收集的细胞中虽然CD133+细胞为数极少，但只有它在传代培养中能形成类似NSC样的肿瘤球，也只有在培养中形成的肿瘤球能无限增殖，而在所有实验中得到的肿瘤球均表达正常NSC的表面标记物Nestin和CD133，而且这种肿瘤球不表达分化后的神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的表面标记物。肿瘤球展示了很强的自我更新能力，并能分化产生与亲本肿瘤类似的肿瘤，在分化后失去了CD133和Nestin的表达。实验结果显示：肿瘤自我更新能力源于CD133+的细胞，而CD133-的肿瘤细胞群是缺乏自我更新能力的。Galli等[21]利用CD133作为标记物，通过流式细胞仪分别收集CD133+和CD133-细胞，接种于免疫缺陷鼠颅内、腹腔和皮下，结果发现只有CD133+细胞能致瘤。进一步的研究表明：CD133+细胞仅需102数量级就能致瘤，而CD133-细胞即使高达105数量级也不致瘤，由此得出结论：只有CD133+细胞具有无限增殖能力，而CD133-细胞不具备。这样，CD133成为可以鉴定脑肿瘤细胞群中具有NSC类似的细胞组分。

 3NSC和BTSC的内在联系

     目前对于NSC的主要研究方向有两个：一是通过细胞移植或激活人体自身的干细胞和内源性修复机制来替代受损的神经细胞，二是作为基因或药物的良好载体用于相关研究。而BTSC的提出，为其开辟了第三个研究领域，从发展前景来看，可为脑肿瘤的治疗寻找新的思路，或许还能为肿瘤发生、发展的分子病因研究提供靶细胞；前提条件是要阐明两者的内在联系。我们曾对胶质瘤病人机体中存在的正常胶质细胞（NGC）、NSC和BTSC三者关系作过探讨，提出了三者可以互相转化的假设[22]。

     目前最受关注的是BTSC是否由NSC转化而来。回顾历史，早在上世纪30~40年代，就有学者提出脑胶质瘤源于室管膜下区的胶质细胞。到70年代，Druckrey利用化学致癌剂N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）诱导怀孕晚期母鼠，成功地在幼鼠中产生了脑肿瘤。随后Lantos发现，发病前的鼠脑室管膜下区已经产生“癌前病变”，于是他更加相信脑肿瘤来源于室管膜下区的细胞。进入90年代，随着神经干细胞研究的深入，推测富集于室管膜下区的Nestin阳性细胞即NSC[23，24]。Nestin在NSC、前体细胞以及瘤性神经细胞中均有表达，提示三者之间在细胞发生学上存在渊源关系。据此，Recht等[23]利用前述的ENU致瘤模型，并选择Nestin为标记物进行胶质瘤起源细胞的研究，结果发现，幼鼠出生后最早30d即可在室管膜下区附近的脑实质中出现单个或成团的Nestin阳性细胞，随着时间的延长，Nestin阳性细胞团逐渐增大，形成实体瘤；而对照组相同部位未发现Nestin阳性细胞。尽管这只是一种说明脑肿瘤来源于神经干细胞的间接证据，但进一步研究发现，BTSC与NSC的生物学特性非常相似，这坚定了继续研究的信心。Berger等[25]认为单一细胞经4~7次突变就有可能发生恶性转变，组织更新越快，复制、转录过程中发生基因突变的概率就越高。NSC是中枢神经系统最活跃的细胞，长期处于分裂、增殖状态，容易发生突变，因此突变的NSC就有可能转变为BTSC。Recht等[23]比较了早期病变和肿瘤组织中的Nestin阳性细胞，结果发现两者存在差异，于是他认为，室管膜下区是神经干细胞发生恶性转变的重要场所，但不是最后场所，发生了部分恶性转变的NSC迁移至室管膜下区之外的脑实质中，继续完成恶性转变。至于形成星形细胞瘤、少枝胶质瘤还是其他类型的肿瘤，他认为与局部微环境相关。Beachy等[26]认为，NSC经不对称分裂形成一个新干细胞和一个前体细胞。在原癌基因被激活的NSC（突变干细胞），蛋白激酶使癌基因的表达产物磷酸化，并沉淀于细胞的一侧，不对称分裂时形成的前体细胞继承所有癌基因表达产物，并迁徙至远处的脑实质，继续恶性转变，形成肿瘤灶；而子代干细胞中的癌基因产物则被清除，继续留在室管膜下区。由此可见，突变的NSC在微环境（蛋白激酶等）的影响下，源源不断地提供向远处迁徙、能形成肿瘤的前体细胞。不对称分裂的假说和Recht的研究结果均揭示：脑肿瘤的根源在室管膜下区，而肿瘤形成却在室管膜下区之外的脑实质。这一理论为脑肿瘤易复发、难根治提供了新的解释。事实上，上述肿瘤起源细胞学说正在受到“细胞融合”理论的挑战[27]，该理论认为：肿瘤细胞染色体整倍性是一种细胞与另一种细胞融合的结果，在髓母细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤的干细胞尤其如此[28]，我们的研究也见到了这一现象[29]（图2）。据此，由干细胞和出现一组肿瘤相关基因突变的细胞发生融合的细胞是肿瘤起源细胞的学说正在形成。但不管是哪一种学说，均与机体干细胞相关。

     4NSC和BTSC的本质区别

     NSC和BTSC分别是神经胶质细胞和神经胶质瘤细胞的起动细胞，上述相似性从某种意义上说是一种“表面”现象，差异性才有可能是其“本质”所在。分化走向的不同是最显著的差异之一。在我们的体外实验中已经证实，NSC和BTSC在含有生长因子的无血清培养条件下，虽然均呈难以区分的球体状悬浮生长，并在去生长因子、加血清条件下均呈贴壁生长和趋向分化，但两者的分化走向截然不同。NSC在10~14d左右分化成熟，失去表达CD133和Nestin的能力，大部分为GFAP阳性的星形胶质细胞，小部分为NSE阳性的神经元细胞；而BTSC虽然在不同的时间点上也出现了不同的形态表型的分化趋向，但没有固定规律，而且经过一定时间“分化”后，总有一部分细胞返回到聚焦成团、呈悬浮生长的干细胞状态。这种“返祖”性的分化障碍我们认为是BTSC有别于NSC的本质区别（图3）。从治疗学角度考虑，诱导分化胶质瘤细胞向良性方向分化，曾经是一个热门话题，我们在体外[30]和体内[31]的研究中均见到了促分化效应，但因达不到终末分化而疗效有限。促分化后细胞凋亡现象研究表明[32]，凋亡与肿瘤细胞分化障碍的根本原因未能解除有关。现在看来，凋亡有可能与诱导分化剂对BTSC不敏感有关，因此，开发针对BTSC的特异诱导分化方法是值得关注的研究新方向。

事实上，BTSC的分化障碍是由其细胞遗传和分子遗传学本质决定的。我们用CD133Kit分筛人胚胎脑组织和人脑胶质瘤组织中的NSC和BTSC，G显带结果表明：NSC为正常核型，而BTSC因来源的肿瘤组织类型和复发前后不同而表现为不同的核型，说明BTSC存在组织特异性。CGHarray技术是我们继cDNAarray后对胶质瘤细胞分子遗传学研究开展的又一新技术，在分析了我们建立的多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞系中的基因变化和染色体定位的基础上，又对NSC与初发（BTSC-1）和复发（BTSC-2）作了比较，在2621个克隆中，BTSC-1和BTSC-2的共同特征是丢失或扩增的克隆分布十分广泛，在半数以上的染色体中发生了变化。这从遗传学上说明，从NSC到BTSC发生了“翻天覆地”的变化，且这种变化随着复发更为剧烈，提示肿瘤的发生和发展的遗传学改变在BTSC，甚至更早期阶段已经发生了，其责任分子存在于NSC和BTSC差异分子群中，也有可能是引起NSC突变的分子；进一步研究这些分子变化将有十分重要的意义。

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