F90对胶质母细胞瘤细胞的作用及机制研究

作者：刘方军    作者单位：北京市神经外科研究所， 北京 100050     【摘要】  目的 探讨表皮生长因子受体 （EGFR） 抑制剂F90对胶质母细胞瘤 （GBM） 细胞的抑制作用及其机制。 方法 采用MTT法检测F90对GBM细胞的抑制作用，流式细胞术检测细胞凋亡和免疫印迹法 （Western Blot） 检测蛋白表达。 结果 F90能明显抑制U251和SHG-44细胞的生长，半数抑制浓度 （IC50） 分别为 （5.8 ± 1.3） 和 （5.1 ± 1.2） μmol/L，且呈一定的剂量相关性。F90可以诱导U251细胞的凋亡，抑制U251细胞EGFR的磷酸化及其丝裂原活化的蛋白激酶 （MAPK） 通路下游信号的活化，下调Bcl-2蛋白的表达，上调P53蛋白的表达。 结论 F90能有效抑制某些GBM细胞在体外的生长，与Iressa作用强度相当，有可能成为一种新的治疗GBM的药物。

    【关键词】  胶质母细胞瘤 受体 表皮生长因子

    Effect and antitumor mechanism of F90 on glioblastoma cells

    LIU Fangjun1, GUI Songbai2, SUN Zelin1, et al.

    1. Beijing Neurosurgical Institute, Beijing 100050, China;  2. Department of Neurosurgery, Beijing Tiantan Hospital,

    Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China

    Abstract:  Objective  To investigate the antitumor effects and antitumor mechanism of F90, a kind of inhibitor of epidermal growth factor receptor (EGFR) on glioblastoma (GBM) cells.  Methods  Antitumor activity of F90 was detected by MTT assay. The antitumor mechanism was investigated by flow cytometry and Western Blot assay.  Results  U251 and SHG-44 cells were inhibited by F90 in a dose-dependent manner in vitro. The 50% inhibitory concentration (IC50) of them was 5.8±1.3 and 5.1±1.2 μmol/L, respectively. F90 inhibited phosphorylation of EGFR and downstream signaling proteins of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, up-regulated P53 protein and down- regulated Bcl-2 protein, induced cell apoptosis confirmed by flow cytometry.  Conclusion  F90 is effective for growth inhibition of some GBM cells in vitro and has a similar effect to Iressa, therefore may be a novel potent agent for GBM.

    Key words:  glioblastoma;  receptor, epidermal growth factor;        在高度恶性的胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤 （GBM） 中经常能见到表皮生长因子受体 （EGFR） 的过表达[1]。由英国阿斯利康研发的 Iressa （Gefitinib，ZD1839） 是一种选择性的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，在体外对高表达EGFR或转染EGFR基因的GBM有抑制生长及抗侵袭作用[2]。F90是中国医学科学院药物研究所自主研制开发的一种Iressa前药，在体外经脂酶孵育或体内经胃酸作用后可以转化为有活性的Iressa，已经申请了中国专利与国际专利。本实验旨在观察F90对GBM细胞的抑制作用及其机制。

    1    对象与方法

    1.1    药品与试剂    F90由中国医学科学院药物研究所化学合成室提供，经脂酶孵育24 h后用于体外实验，对照药物Iressa购自英国阿斯利康公司。两种药物均采用二甲基亚砜 （DMSO） 配制，对照组加入相同剂量的DMSO （浓度不超过0.1%）。一抗购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Promega公司。

    1.2    细胞株    人GBM细胞株SHG-44、TJ899和TJ905由中国医学科学院药物研究所药理室惠赠，BT325和U251由北京市神经外科研究所细胞室提供。均采用含10%胎牛血清 （FBS）、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM培养基，0.25% 胰酶-乙二胺四乙酸 （EDTA） 消化，在含5% CO2的37 ℃培养箱中培养传代。

    1.3    MTT法测定肿瘤细胞存活率    按 1 000个细胞/孔接种于96孔板，次日加含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每组设3个平行孔，培养96 h后，每孔加用无血清培养基新鲜配制的5 g/L MTT 100 μl，继续培养4 h，然后每孔加200 μl DMSO溶解甲臜颗粒，振荡混匀后，MK3型酶标仪 （Labsystems，Dragon，Finland） 测定光密度值 （OD），参考波长450 nm，检测波长570 nm；抑制率 （%） = （给药组OD值-对照组OD值） /对照组OD值 × 100%。半数抑制浓度 （IC50） 由线性方程计算，通过药物浓度对生长抑制率的回归曲线进行推算。

    1.4    流式细胞术检测细胞凋亡    不同浓度化合物 （Iressa 5 μmol/L，F90 2.5、5 和10 μmol/L）作用U251细胞48 h后，收集贴壁细胞，用预冷PBS洗2次，按1　∶　1　∶　50 比例将Annexin V-异硫氰荧光素 （FITC）、碘化丙啶 （PI） 和4-羟乙基哌氰乙磺酸 （HEPES）  缓冲液配成Annexin V-FITC/ PI染液。每100 μl 染液重悬1 × 105个细胞，室温下孵育15 min后加入1 ml HEPES缓冲液混匀上机。以激发波长488 nm，发射波长 525、575 nm分别检测FITC 和PI 荧光。每样本收集10 000个细胞荧光信号。

    1.5    Western Blot杂交分析蛋白表达    将不同浓度化合物 （Iressa 5 μmol/L，F90 2.5，5 和10 μmol/L） 作用U251细胞48 h后，收集贴壁的细胞，从3 × 106个细胞中提取蛋白质，裂解液裂解细胞。采用Bradford法计算蛋白质含量，然后用细胞裂解液将各样品调至相同浓度，取各组蛋白质样品120 μg，上样30 μl，经8%和10% 十二烷基硫酸钠 （SDS）-PAGE电泳后，用半干法转膜，加入稀释的一抗，常温孵育2 h或4 ℃过夜，洗膜3遍，加入相应的二抗，常温孵育2 h或4 ℃过夜，洗膜后，用增强化学发光法 （ECL Plus，Amersham Pharmacia Biotech，USA） 显影并采集图像。

    1.6    统计分析    所有试验均重复3遍，结果用x ± s表示，Western Blot结果用Image J软件测条带灰度值进行半定量分析，采用SPSS 12.0软件进行t检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

    2    结    果

    2.1    F90对GBM细胞的生长抑制作用 （表 1）    MTT结果显示：F90对U251、SHG-44细胞有显著的生长抑制作用，IC50值分别为 （5.8 ± 1.3） 和 （5.1 ± 1.2） μmol/L；且呈剂量依赖性，在剂量为12.5 μmol/L时能显著抑制肿瘤细胞的生长，当达到25 μmol/L时抑制率接近100%；对TJ899和TJ905细胞有一定的抑制作用；对BT325细胞则需高剂量才能呈现抑制作用。

    2.2    F90诱导U251细胞凋亡 （图 1）    不同浓度的药物作用细胞48 h后，用流式细胞仪检测，Annexin V-PI染色，将早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞区分。与对照组相比，随着药物剂量的增加，凋亡细胞的数目逐渐增加；与阳性药物Iressa相比，F90与其效果相似，在浓度为5 μmol/L时即能显著诱导细胞凋亡。

    2.3    Western Blot结果 （图 2，表 2）    由于Iressa选择性作用于磷酸化的EGFR，F90是Iressa的前药，因此，我们主要检测U251细胞磷酸化的EGFR及其丝裂原活化的蛋白激酶 （MAPK） 通路下游蛋白的关键蛋白。F90对磷酸化EGFR、细胞外信号调节激酶1 （ERK1）、P38和c-jun氨基末端激酶 （JNK） 蛋白表达有下调作用，且随着剂量的加大，抑制作用更加明显。药物下调Bcl-2蛋白的表达，上调P53蛋白的表达，且与剂量有一定的相关性。同剂量的F90与Iressa效果相似。

    3    讨    论

    大约40%～50%的GBM高表达EGFR[3]，这与GBM病人的预后不良，短时间内复发，对化疗、放疗抵抗等有关[4]。因此，阻断依赖EGFR的信号传导通路即可阻止肿瘤的生长，而EGFR阻断剂 （包括单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂） 作为肿瘤治疗的方法已成功应用于临床[5]。

    本研究MTT结果表明：F90与Iressa具有相似的作用，只是对某些GBM细胞的生长有较好的抑制作用，且呈一定的剂量依赖性，其原因及机制有待于进一步研究。

    本研究选用了对两种药物均敏感的U251细胞来探讨其作用机制。细胞凋亡是抗肿瘤作用的重要机制之一，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白P53在细胞凋亡的过程中起着关键的作用[6]。黄海燕等[7]曾报告过125I在体内及体外有诱导SHG-44细胞凋亡的作用，主要机制可能与抑制Bcl-2蛋白的表达、上调P53蛋白的表达有关。本研究Western Blot也显示了类似的结果，说明F90诱导细胞凋亡主要通过下调Bcl-2蛋白、上调P53蛋白而发挥作用。

    EGFR重要的下游通路是MAPK通路，而ERK、JNK和P38是这条通路的下游信号蛋白[8]。MAPK通路与胶质瘤生长及病人预后不良有着密切的关系，与正常组织相比，瘤组织中MAPK的表达明显升高[9]。本研究结果显示：F90在体外作用于U251细胞48 h后，可以抑制磷酸化EGFR的表达，同时下调下游磷酸化ERK1、JNK和P38蛋白的表达，说明EGFR-MAPK信号传导通路受到了抑制。这种下调可能是F90体外抑制U251细胞生长的主要原因。因此，我们推断：F90抑制U251细胞生长的机制可能是通过直接阻止EGFR的磷酸化，从而阻断了MAPK下游通路的信号传导。

    总之，本研究结果表明：F90有希望成为用于治疗高表达EGFR的GBM病人的新药。

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